UNIVERSIDADE PROFESSOR EDSON ANTÔNIO VELANO

UNIFENAS
CURSO DE MEDICINA

ALINE GARCIA FIGUEIREDO

DEMETRIUS RUBEN BORGES DE REZENDE
GISLAINE MARQUES FARIA

Subturma A4

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE GENÉTICA MÉDICA

1° BIMESTRE

Alfenas
2023
 2

UNIVERSIDADE PROFESSOR EDSON ANTÔNIO VELANO

UNIFENAS
CURSO DE MEDICINA

ALINE GARCIA FIGUEIREDO

DEMETRIUS RUBEN BORGES DE REZENDE
GISLAINE MARQUES FARIA

Subturma A4

RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE GENÉTICA MÉDICA

1° BIMESTRE

Relatório de aulas práticas, requisito de

avaliação da disciplina de Genética Médica
Profa. Dra. Danielly Beraldo dos Santos Silva

Alfenas
2023
 3

Aula 1

Técnicas básicas de biologia molecular: Extração do DNA pelo método caseiro

Introdução

É importante iniciar o estudo da genética médica com a abordagem da técnica

de extração de DNA, devido a ela se basear toda a execução de testes genéticos.
Assim, o enfoque em biologia molecular pode ser útil na genética médica para a
realização de exames de diagnóstico laboratorial e pesquisa de causas e padrões de
herança de doenças genéticas. Uma vez extraído, o DNA pode ser amplificado por
técnicas como a de reação em cadeia da polimerase (PCR), possibilitando assim,
análises mais fidedignas.
O estudo genético pode contribuir na prevenção e controle de doenças a
partir do estudo de genes, cromossomos e genoma. Baseado nisso, a técnica de
extração do DNA pode ser realizada a partir de vários materiais biológicos, como:
sangue, pele, sêmen, saliva, unhas e cabelo. No entanto, é necessário se atentar a
especificidades de cada tipo de amostra, uma vez que cabelos e unhas são
estruturas protéicas mortas e, portanto, não possuem por si, material genético.
Assim, a análise de cabelos ou pelos apenas é possível quando ainda
preservado o bulbo capilar, do qual é possível se realizar essa extração. Da mesma
forma, as unhas apenas são úteis quando nelas se encontra retido material genético,
como células cutâneas. Além disso, em amostras de sangue deve-se utilizar como
base leucócitos, uma vez que os eritrócitos já não possuem mais núcleo celular e,
portanto, não há presença de material genético. Por fim, na extração de DNA em
amostras de sêmen, há a necessidade de primeiramente realizar a separação do
líquido seminal, das células propriamente ditas.
O processo de extração do DNA é constituído por quatro etapas principais,
sendo elas: a lise das célulaspresentes na amostra, a purificação do DNA,
desidratação do DNA e reidratação do DNA. A lise das células consiste na
realização do rompimento das membranas celulares que a constituem, com o
objetivo de liberar o material genético; enquanto que a purificação do DNA baseia-se
na separação do material genéticodos restos celulares, por meio da precipitação e
suspensão em volume adequado de água ultra pura ou soluções-tampão
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adequadas. Para cada tipo de amostra, vários protocolos podem ser testados,
adaptados eotimizados de maneira a se conseguir DNA de boa qualidade.
Após a extração é necessário determinar a concentração do DNA extraído,
esse processo pode ser feito por espectrofotometria, nanodrop e picodrop,
possuindo o DNA uma leitura de absorbância em um comprimento de
aproximadamente 260 nm e as proteínas de aproximadamente 280 nm.
A eletroforese é uma técnica utilizada para separar, identificar e
purificarfragmentos de DNA e proteínas, separando as moléculas ionizadas de
acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular. As moléculas com carga
negativa migram para o pólo positivo (ânodo), enquanto as de carga positiva migram
para o pólo negativo (cátodo). Os ácidos nucléicos possuem carga total negativa,
pois a estrutura do DNA é constituída de grupos fosfatos e por essa razão migram
sempre para o polo positivo. Para que ocorra a captação da molécula de DNA é
utilizado a carga elétrica, através do reagente cloreto de sódio, por exemplo o sal de
cozinha. Por sua vez, para que ocorra a precipitação é adicionado álcool. Ademais, é
utilizado temperatura para otimizar esse processo, nesse caso foi utilizado o banho
maria, afim de provocar uma sepração das fitas da molécula de DNA.
A eletroforese pode ser conduzida em variados meios de suporte como: sílica
gel, papel filtro, membranas de acetato de celulose, gel de acrilamida e gel de
agarose, este método permite a análise de componenetes de uma amostra, a fim
deavaliar de forma qualitativa a integridade de fragmentos de DNA.
O armazenamento adequado do DNA é essencial para manter sua
integridade ao longo do tempo, permitindo que ele seja usado em análises futuras.
Portanto, para o armazenamento do DNA pode ser utilizado a água ultra pura, isso
ajuda a protege-lo da degradação. O armazenamento do DNA em geladeira,
mantendo uma temperatura de 4°Ctem uma durabilidade a curto prazo de 40 dias.
No entanto, o armazenamento em freezer com temperatura -20°C aumenta
suadurabilidade para 10 anos, por sua vez, em um armazenamento em freezer a
uma temperatura de-80°C a durabilidade mantém, consideravelmente, por um
enorme espaço de tempo.
Após a extração de DNA, é necessário, realizar a quantificação e qualificação
das amostras, que por meio de uma razão é analisado a pureza do material extraído
através de feixes de luz. O resultado dessa razão deve ser de 2 (ideal), de 1,75 até
1,8 (boa qualidade) e menor que 1,75 o material podeapresentar-se contaminado por
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lipídios ou proteínas (nesse caso, se constatar a contaminação deve-se jogar o

material fora e fazer tudo novamente).

Objetivo

Empregar a técnica caseira para a extração do DNA de mamão.

Procedimentos

1. Em um béquer de 500 mL, adicionou-se a uma porção de mamão

previamente picado, e triturou-se com o auxílio de um mixer.
2. Em um béquer de 100mL, preparou-se a solução de lise, que consistia em
6 mL de detergente concentrado e 4g decloreto de sódio, completando o
volume com água até 60mL.
3. Adicionou-se a solução de lise (60mL) ao béquer de 500mL contendo o
mamão triturado.
4. Homogeneizou-se a solução de lise com a polpa de mamão e colocou-se o
béquer em banho-maria(55°C) por 10min. Tomando-se o cuidado de manter o
sistema a essa temperatura, para evitar a degradação do DNA.
5. Decorrido este tempo, levou-se o béquer ao congelador por 5 min a fim de
estimular um choque térmico e interromper a reação.
6. Filtrou-se 4mL da solução para um tubo de ensaio.
7. Adicionou-selentamente na parede de um tubo de ensaio 4 mL de etanol
gelado.
8. Durante a adição do etanol, observou-se atentamente a formação de fases
com o isolamento do DNA

Resultado obtido da extração de mamão

após a realização dos procedimentos
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Discussão

1. Quais as características celulares que justificam o uso de detergente e

sal na extração de DNA? Justifique.

A membrana plasmática é composta, principalmente, por lipídios. Nesse caso,

a função do detergente é desestruturar as moléculas de lipídio das membranas
biológicas. Desta maneira, as membranas sofrem ruptura e todo o conteúdo celular -
inclusive o DNA - fica disperso no meio. Após ocorrer essa quebra da membrana
celular, em que o conteúdo de DNA foi exposto ao meio, faz-se necessário a
captação da molécula de DNA. Pôr a molécula de DNA ser eletronegativamente
carregada é feito a adição do sal (NaCl) no meio em que o DNA está presente, para
que ocorra uma dissociação do NaCl. Assim, o Na- que é um íon positivo- contribui
para que ocorra a neutralizaçãoda carga negativa do grupo fosfato do DNA. As
moléculas de DNA passam a não sofrer repulsão de cargas entre si, o que favorece
sua aglomeração.

2. Considere os seguintes resultados de espectrofotometria e corrida de

eletroforese em gel de agarose:Qual (is) amostra (s) deveria (m) ser re-extraída
(s)? Justifique com base nos resultados, conhecimentos obtidos em aula e
referências bibliográficas.

Após a extração de DNA, é realizadouma quantificação das amostras de

DNA, que por meio de uma razão obtidaserá possível analisar a pureza do material
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extraído através de feixes de luz.Quanto maior for a absorção de luz no comprimento

de onda de 260 nm, maior será a concentração de DNA na amostra.
O resultado dessa razão deve ser de 2 (ideal), de 1,75 até 1,8 (boa qualidade)
e menor que 1,75 o material pode apresentar-se contaminado por lipídios ou
proteínas. Por sua vez, a eletroforese avalia de forma qualitativa a amostra e será
capaz do examinador observar o grau de intensidade das bandas.
Após uma análise cuidadosa das amostras, tanto em termos quantitativos
quanto qualitativos, foi possível identificar que as amostras numeradas como 4 e 5
devem ser re-extraídas. Na análise quantitativa por espectrofotometria observa-se
que a razão 260/280 apresenta-se com valores de 1,55 e 1,6, já as concentrações
encontram-se 20 e 40, para as amostras em questão. Ademais, ao comparar as
bandas dessas amostras na eletroforese em gel de agarose é possível evidenciar
que as bandas não se apresentam com uma boa intensidade e detectabilidade
quanto comparado com as demais amostras.
Por outro lado, as demais amostras exibiram uma razão e concentração
adequadas, uma constatação reforçada pela nitidez das bandas observadas na
eletroforese em gel de agarose. Desse modo, é viável que as amostras 4 e 5
passem pelo procedimento de re-extração, visando assegurar a integridade da
amostra para garantir que os resultados de suas análises subsequentes
(PCR e sequenciamento genético) sejam precisos, confiáveis e significativos.

3. Após a extração de DNA para análise genética, quais as formas de

armazenamento adequado?

Após a retirada do álcool, o DNA precisa se solubilizar em algum solvente

(H2O ultra- pura), o solvente de reidratação servirá paraarmazenar o DNA extraído,
ele precisa ser livre de contaminantes e enzimas, os quais, são capazes de destruir
o DNA. Feito isso, o armazenamento adequado do DNA é essencial para manter sua
integridade ao longo do tempo, permitindo que ele seja usado em análises futuras.
Desse modo, o armazenamento do DNA poderá ocorrer de 3 modos: em geladeira a
uma temperatura de 4°C o DNA terá uma durabilidade a curto prazo de 40 dias. No
entanto, o armazenamento em freezer com temperatura -20°C aumenta a
durabilidade da amostra de DNA para 10 anos, por sua vez, em um armazenamento
em freezer a uma temperatura de -80°C a durabilidade da amostra de DNA mantém-
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se por um longo período de tempo. Por isso, a depender das análises futuras a
serem feitas, o ideal será manter o armazenamento em freezer, visto que a
durabilidade da amostra é maior e preservará melhor o material genético.

4. A extração de DNA é o primeiro passo na utilização de técnicas moleculares,

este processo é essencial para a utilização em aplicações distintas, como nas
áreas de biotecnologia, médica, forense, entre outros. Neste sentido, baseado
em artigos científicos, pesquise e sintetize um ou mais casos em que o uso de
técnicas moleculares foi essencial para o diagnóstico e/ou tratamento de
doenças, identificação de suspeitos de crimes entre outras possibilidades.

Dentre inúmeras técnicas de biologia molecular que vêm sendo desenvolvidas

e aplicadas para diagnósticos e tratamentos médicos estão o sistema CRISPR, a
qPCR e o NGS. O sistema CRISPR é uma ferramenta molecular, ordenada por um
RNA guia e a enzima denominada Cas9, capaz de corrigir a expressão de uma
gama de genes alvo, o que é um artifício promissor para o tratamento de diversas
doenças. A revisão de literatura de Barbosa e Cavalcante (2019) relata o uso do
sistema CRISPR para corrigir a mutação intrônica no gene CYBB na doença
granulomatosa crônica; a mutação/supressão de 1 pb na síndrome de Bath; as
mutações C > T, A/G e TCTT no gene HBB na beta talassemia; a deleção de 75484
pb (incluindo o éxon 44) do gene na distrofia muscular de Duchenne; e a inversão do
gene 140 kb e 160 kb do íntron 1 a 22 na hemofilia A. a qPCR é uma técnica
derivada da PCR convencional que possui a capacidade de quantificar os níveis de
ácidos nucleicos em tempo real durante a amplificação do material genético, o que
tem sido uma ferramenta importante para o diagnóstico de arboviroses como a
dengue, o Zica vírus, a febre amarela, o vírus West Nile e a chikungunya (LICÍNIO;
AYRES, 2021). O NGS, por fim, é uma técnica de sequenciamento paralelo massivo
do DNA, o que seria uma evolução da tecnologia utilizada no projeto genoma
humano (PGH), e que vem sendo empregada para o diagnóstico precoce de
doenças de difícil detecção, como neoplasias, fibrose cística, distrofia muscular,
lúpus, artrite reumatoide, doença de Parkinson e doença de Alzheimer (IRIART,
2019).
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Conclusão

Mediante ao mencionado, é possível concluir que a biologia molecular

desempenha um papel fundamental na genética médica, a qual é uma especialidade
que permite a realização de diagnósticos laboratoriais e a investigação das causas e
padrões de herança de doenças genéticas. A extração de DNA é o ponto de partida,
pois a análise de genes, cromossomos e genoma pode fornecer a compreensão de
doenças hereditárias e auxiliar na identificação de abordagens terapêuticas. Para
isso, a compreensão das etapas de extração, quantificação, análise e
armazenamento do DNA são fundamentais para a realização bem-sucedida de
estudos genéticos e avanços na medicina.

Referências

BARBOSA, K. L.; CAVALCANTE, G. S. S. A biotecnologia envolvida no sistema

CRISPR. Revista de Ciências Médicas e Biológicas, v. 18, n. 1, p. 123-127, 2019.

IRIART, J. A. B. Medicina de precisão/medicina personalizada: análise crítica dos

movimentos de transformação da biomedicina no início do século XXI. Cadernos de
saúde pública, v. 35, p. e00153118, 2019.

LICÍNIO, C. O. L.; AYRES, F. M. O uso de PCR em tempo real em diagnósticos de

arboviroses: revisão integrativa. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina
Laboratorial, v. 57, 2021.
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Aula 2

Técnicas básicas de biologia molecular: Identificação de variantes

Introdução

O ácido desoxirribonucleico (DNA) possui uma estrutura complementar, em

dupla-hélice, e é composto principalmente por nucleotídeos com quatro tipos de
bases nitrogenadas, sendo duas purinas: adenina (A) e guanina (G), e duas
pirimidinas: citosina (C) e timina (T). A ordem em que estes diferentes nucleotídeos
se combinam na molécula de DNA é o que determina a informação genética
necessária para o funcionamento de um organismo. Assim como o DNA, o RNA
(ácido ribonucleico) também possui a capacidade de armazenar e transmitir
informações genéticas. A estrutura química destes ácidos nucleicos é muito
importante para a estabilidade das moléculas, sendo que, ambas são formadas por
nucleotídeos compostos por uma base nitrogenada, uma pentose e um ou mais
grupamentos fosfato. O que diferencia o DNA do RNA é principalmente a estrutura
de sua molécula de açúcar, que no DNA é uma desoxirribose e no RNA uma ribose.
Além disso, uma das bases nitrogenadas pirimídicas que compõe o RNA difere do
DNA, a uracila (U), ao invés da timina (T). Os nucleotídeos ligam-se entre si de
forma covalente, onde o grupamento fosfato-5' de um nucleotídeo é ligado ao grupo
hidroxila-3' do nucleotídeo seguinte, gerando uma ligação fosfodiéster no esqueleto
das moléculas de DNA ou RNA. A interação entre duas cadeias complementares de
ácidos nucleicos ocorre através de ligações de hidrogênio que se formam entre os
grupos amino e carbonila das purinas e pirimidinas complementares. Enquanto o
DNA é encontrado nas células em dupla fita, o RNA é encontrado em fita simples.
Porém, uma fita de RNA geralmente apresenta a formação de estruturas
secundárias devido à complementariedade de suas bases nitrogenadas, que
acabam formando regiões de fita dupla.
A genética molecular ganhou força após a descrição da estrutura da molécula
de DNA em 1953 por Watson e Crick, que descreveram os padrões mais comuns de
ligações de hidrogênio entre as bases nitrogenadas, onde A liga-se a T e G liga-se a
C, formando interações específicas. A sequência em que estes nucleotídeos se
arranjam nas moléculas de ácidos nucleicos é um dos principais alvos de estudos da
genômica. Nas décadas subsequentes, entre 1970 e 1980, esta área teve avanços
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significativos com o surgimento das primeiras metodologias para amplificação e

sequenciamento de DNA. Tais técnicas consistiam principalmente em métodos como
o de degradação química (Maxam e Gilbert, 1977) ou o método Sanger com
terminação de cadeia por dideoxinucleotídeos (Sanger et al., 1977). Desta forma,
primariamente restrita a estudar pequenos fragmentos de DNA ou poucos genes, a
genômica teve uma grande alteração de paradigmas com o aumento do
conhecimento químico sobre os nucleotídeos e ácidos nucleicos, culminando no
desenvolvimento de técnicas inovadoras para o sequenciamento de DNA em larga
escala.
Entre as diversas técnicas de sequenciamento em larga escala que surgiram,
destacam-se: o pirosequenciamento com detecção de pirofosfato, o sequenciamento
por ligação da tecnologia SOLiD, a metodologia de semicondutores Ion e o
sequenciamento por síntese na tecnologia Illumina. Ainda, novos métodos vêm
sendo constantemente testados, aprimorados, ou ainda incorporados por outras
tecnologias, tais como a tecnologia Helicos, o Pacific Biosciences e o Oxford
Nanopore, que utilizam principalmente a premissa de sequenciamento de moléculas
únicas em larga escala. Os eventos marcantes para o desenvolvimento dos métodos
de sequenciamento de DNA, que culminaram nas principais técnicas conhecidas,
podem ser cronologicamente organizados.
Hoje em dia o chamado sequenciamento de nova geração (NGS – Next
Generation Sequencing) permitiu aumentar consideravelmente a escala das análises
genômicas, sequenciando e genotipando milhares de regiões e genomas de
interesse.
Neste trabalho utilizou as estruturas de ferramentas de pesquisa e análise de
sequência do EMBL-EBI, que fornecem acesso integrado aos recursos de dados e
às principais ferramentas analíticas de bioinformática. EBISearch
(https://www.ebi.ac.uk/ebisearch) fornece um mecanismo de pesquisa de texto
completo para quase 5 bilhões de entradas, e Job Dispatcher.
A estrutura de ferramentas do Job Dispatcher (JD) fornece acesso integrado
aos principais aplicativos de bioinformática e aos dados biológicos necessários.
O catálogo de ferramentas JD inclui algumas das potências mais populares
em bioinformática, desde aplicações de pesquisa de similaridade de sequências,
como NCBIBLAST+ e FASTA, alinhamento de múltiplas sequências e ferramentas
de alinhamento de sequências de pares, como Clustal Omega e Kalign, ferramentas
 12

para funções funcionais anotação e previsão como Inter ProScan5, ferramentas de

análise de RNA como R2DT, utilitários de análise de sequência de dentes. O uso de
ferramentas de busca por similaridade de sequências compreende mais de 45.000
bibliotecas de sequências distintas dos principais recursos de banco de dados
hospedados no EMBL-EBI, incluindo UniProtKB, ENA e Ensembl Genomes. A
estrutura JD fornece uma interface entre clusters de computação de alto
desempenho e aplicativos de linha de comando.

Visão geral

A proposta da aula prática foi facilitar a aprendizagem da genética médica.

Através de ferramentas computacionais para avaliação de dados de sequenciamento
com o objetivo de identificar alterações genéticas. A identificação de molecular de
doenças é fundamental, dado o impacto no diagnóstico e tratamento do paciente,
mas também pelas implicações para seus familiares, que podem apresentar risco
aumentado para a doença. O treinamento em identificação da predisposição
hereditária ou diagnóstico de doença genética existente visa qualificar alunos do
curso de medicina para atender, futuramente, pacientes e seus familiares, com
ênfase no aconselhamento genético e conduta.

Objetivo

Vivenciar a experiência de identificar variantes e analisar laudos de predisposição

hereditária ao câncer

Procedimentos

Fazer Download das sequencias dos pacientes (SCN4A.txt):

• Acessar o programa Clustal W: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/

• Em “STEP 1- Enter or paste a set of” modificar para DNA
• Abrir o arquivo da sequência, selecionar (ctrl A), copiar as sequencias (ctrl C)
e colar (ctrl V) no “sequences in any supported format”
• Clicar em “Submit” • Observar os nucleotídeos e as possíveis alterações
ocorridas.
• Após identificar a mutação nas sequências de cada paciente, copiar o rs000
presentes nos laudos e inserir em https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
 13

• Clicar no link rsXXX para escrever a interpretação do resultado

• Clicar em LitVar2 para obter os artigos e alteração na sequência de
aminoácidos https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/litvar2/, copiar e colar o
rs000

Discussão

Paciente 2 – Laudo
Resultado: Foi detectada uma variante no gene SCN4A, classificada como
Patogênica/Provavelmente patogênica
Sequenciamento: Gene SCN4A
Coordenada genômica: chr17:63957515
Alteração na sequência de nucleotídeos: c.2023C>T
Alteração na sequência de aminoácidos: p.(Arg675Trp)
dbSNP: rs121908556
Classificação: Substituição de base do tipo sem sentido
Interpretação do resultado: A variante c.2023C>T, p.(Arg675Trp),
identificada em heterozigose no gene SCN4A, resulta na substituição de um
aminoácido por um códon de parada prematuro no RNA mensageiro
(mRNA), com impacto na proteína codificada e desta forma, a variante é
descrita como provavelmente patogênica na literatura especializada e no
banco de dados LitVar2 (PMID: 36964512; 32962503; 31708864;31555136;
29930533).
Correlação com o quadro clínico e diagnóstico: A alteração encontrada
pode estar associada com os quadros clínicos: Paramiotonia congênita de
Von Eulenburg, Paralisia periódica hipercalêmica familiar, paralisia periódica
normokalêmica sensível a potássio. O quadro clínico do paciente é
compatível com paramiotonia congênita de Von Eulenburg – o qual é
confirmado pela presença da mutação c.2023C>T no gene SCN4A. Os níveis
séricos para CPK (Creatinofosfoquinase), são: 55-170 unidades por litro
(U/L), para homens, e: 30-135 U/L, para mulheres. A paramiotonia congênita
de Von Eulenburg é uma condição na qual os indivíduos afetados podem
apresentar distúrbio que afeta os músculos usados para o movimento
(músculos esqueléticos). Começando na infância ou na primeira infância, as
 14

pessoas com essa condição experimentam crises de tensão muscular

sustentada (miotonia) que impedem que os músculos relaxem normalmente.
A miotonia causa rigidez muscular que normalmente aparece após o
exercício e pode ser induzida pelo resfriamento muscular. Essa rigidez afeta
principalmente os músculos da face, pescoço, braços e mãos, embora
também possa afetar os músculos usados para respirar e os músculos da
parte inferior do corpo. Ao contrário de muitas outras formas de miotonia, a
rigidez muscular associada à paramiotonia congênita tende a piorar com
movimentos repetidos.
Indicação de tratamento: O manejo dos pacientes consiste em terapia
médica e prevenção de fatores desencadeantes (exposição ao frio, jejum e
exercícios extenuantes/prolongados). A rigidez muscular (miotonia) responde
bem aos bloqueadores dos canais de sódio. Mexiletina ou carbamazepina
são os tratamentos de escolha. A acetazolamida pode ser útil para prevenir
ataques de fraqueza e também pode melhorar a miotonia em alguns casos. A
fisioterapia com massagens e alongamentos pode ser útil contra dores e
retrações. Monitoramento rigoroso é necessário durante a cirurgia e
anestesia. Os agentes despolarizantes podem induzir espasmos do masseter
e rigidez dos músculos respiratórios e outros e, portanto, podem prejudicar a
intubação e a ventilação mecânica. Os relaxantes musculares
despolarizantes são, portanto, contra-indicados. Os pacientes miotônicos são
considerados suscetíveis à hipertermia maligna; anestésicos voláteis e
suxametônio devem ser proibidos.

Paciente 3 – Laudo
Resultado: Foi detectada uma variante no gene SCN4A, classificada como
Interpretações conflitantes de patogenicidade; Significado incerto (2);
Benigno (5); Provavelmente benigno (3).
Sequenciamento: Gene SCN4A
Coordenada genômica:
Alteração na sequência de nucleotídeos:c.4690G>A
Alteração na sequência de aminoácidos: p.(Val1564Ile)
dbSNP: rs202106192
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Classificação: Substituição de base do tipo sem sentido

Interpretação do resultado: A variante c.4690G>A, p.(Val1564Ile),
identificada em heterozigose no gene SCN4A, resulta na substituição de um
aminoácido por um códon de parada prematuro no RNA mensageiro
(mRNA), com impacto na proteína codificada e desta forma, a variante é
descrita como benigna, provavelmente benigna e de significado incerto na
literatura especializada e no banco de dados LitVar2 (PMID: 32849172;
29245897; 28569743; 26415585; 28050010; 30385747)
Correlação com o quadro clínico e diagnóstico: O quadro clínico do
paciente é compatível com Paralisia periódica hipercalêmica familiar;
Paralisia periódica hipocalêmica, tipo 2; Miotonia agravada por potássio;
Paramiotonia congênita de Von Eulenburg; Síndrome miastênica congênita
16, pois é característico a presença de fraqueza muscular associada ao
aumento das dosagens de potássio (5,6 mEq/L) e dos níveis da CPK (valores
variando entre 209 e 873 U/L), assim como, o esforço físico pode exacerbar
a doença.
Indicação de tratamento: Para o tratamento é indicado reduzir a ingestão
de alimentos ricos em potássio pode ajudar a diminuir a probabilidade de
episódios de fraqueza. Evitar alimentos como bananas, laranjas, batatas,
espinafre, abacates e produtos lácteos, assim como, aumentar a ingestão de
cálcio, é totalmente indicado. Já que o cálcio ajuda a controlar a liberação de
potássio dos músculos para a corrente sanguínea.
Exercício extenuante, estresse emocional, e o frio extremo, devem ser
evitados.
O tratamento farmacológico consiste nos bloqueadores dos canais de cálcio,
como a nifedipina, pois esta, ajuda a regular o fluxo de íons nos músculos,
podendo reduzir a gravidade dos episódios.

Paciente 4 – Laudo
Resultado: Não foi detectada variante no gene SCN4A.
Sequenciamento: Gene SCN4A
Coordenada genômica: chr17:63941940
Alteração na sequência de nucleotídeos: Nenhuma
 16

Alteração na sequência de aminoácidos: Nenhuma

dbSNP: rs121908544
Correlação com o quadro clínico e diagnóstico: A sintomatologia
apresentada, principalmente pela fraqueza muscular progressiva, dificuldade
em subir e descer escadas, queda de objetos das mãos, falta de expressão
facial e ptose facial, são compatíveis com a Esclerose Lateral Amiotrófica
(ELA). A ELA é uma doença neuromuscular progressiva que afeta as células
nervosas no cérebro e na medula espinhal, levando à fraqueza muscular e
atrofia. Embora seriam necessários mais alguns exames específicos para
determinar o diagnóstico, como eletroneuromiografia e a ressonância nuclear
magnética, para descartar outras possíveis causas de fraqueza muscular.

Conclusão
A análise dos dados de sequenciamento, permitiu identificar alterações na
sequência de nucleotídeos e aminoácidos, dos pacientes 1, 2 e 3, assim como
classificar e interpretar os resultados para consequente plano de tratamento. A
identificação molecular de doenças é fundamental, para um diagnóstico mais
assertivo, tratamento adequado, e a utilização da ferramenta para aconselhamento
genético e conduta.

Referências
ADAMS J. DNA sequencing technologies. Nature Education. 1, 2008.

CARVALHO, Rafael Arrabaça de. Avaliação do método de sequenciamento de nova

geração no diagnóstico genético de neoplasia endócrina múltipla tipo 1. Tese de
Doutorado. USP. 2016.

KANAZAWA, Thatiane Yoshie. Avaliação das displasias esqueléticas letais e

investigação das bases moleculares de um fenótipo inédito utilizando
sequenciamento de alto desempenho. Tese de Doutorado. UNICAMP.2018.

MADEIRA F, Pearce M, Tivey ARN, et al. Search and sequence analysis tools
services from EMBL-EBI in 2022. Nucleic Acids Research. Jul;50(W1):W276-
W279. 2022.

MAXAM, Allan M.; GILBERT, Walter. A new method for sequencing DNA.
Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 74, n. 2, p. 560-564, 1977.
 17

SANGER, Frederick; NICKLEN, Steven; COULSON, Alan R. DNA sequencing with

chain-terminating inhibitors. Proceedings of the national academy of sciences, v.
74, n. 12, p. 5463-5467, 1977.

SILVA, Romina Soledad Heredia Garcia. Avaliação da utilização de exames

genéticos complementares previstos na portaria número 199/14 no diagnóstico de
doenças genéticas no Hospital Universitário de Brasília. UNB. 2018.
 18

Aula 3

Técnicas básicas de citogenética: Observação das fases da mitose

Visão geral
A proposta principal desta aula foi identificar as fases da mitose no
microscópio. No entanto, antes de partir para prática é importante compreendermos
o processo da mitose e suas fases. Existem duas fases da mitose que são
consideradas essenciais para a área da medicina, sendo estas fases denominadas
metáfase e anáfase. É na metáfase que ocorrerá o grau máximo de espiralização
dos cromossomos, sendo exatamente nesta fase realizado a indução da célula dos
pacientes para conseguir dar o diagnóstico, por exemplo, de cromossopatias. Por
sua vez, na anáfase ocorrem às disjunções dos cromossomos, por isso uma
alteração nessa fase é possível ser observado à ocorrência dos erros que poderão
acarretar nas cromossopatias. Desse modo, percebe-se que pessoas com
cromossopatias, na maioria das vezes, terão um fenótipo que causará algum
sintoma para o indivíduo e esses sintomas serão, por sua vez, carregados para o
resto da vida.
O ciclo celular é constituído de duas grandes fases: a interfase e a mitose–
em células somáticas. É na interfase que ocorre as etapas G1- crescimento celular-
S- duplicação/replicação do material genético e G2- preparação para a divisão
celular. Seguido pela fase da mitose que terá as etapas de prófase, prometáfase,
metáfase, anáfase, telófase e citocinese. De um modo geral, na mitose, portanto,
ocorre a duplicação dos cromossomos, a migração destes para os pólos da célula,
bem como a divisão do citoplasma. Neste processo, uma célula original ou célula-
mãe, origina duas células-filhas que compartilham a mesma informação genética.
Além disso, há a meiose, no entanto, esse tipo de divisão celular ocorre
apenas em células germinativas. Basicamente, na meiose acontecerá meiose I –
constituída pela prófase I, metáfase I, anáfase I e telófase I- já na meiose II-
ocorrerá a prófase II, metáfase II, anáfase II e telófase II. Sendo que o que vai
diferenciar uma da outra será que na Meiose I acontecerão disjunções
cromossômicas, além disso, na prófase I da meiose I será observado o crossing
over, isto é, processo de permutação de troca de fragmentos homólogos, trazendo a
variabilidade genética para a célula, enquanto que, na Meiose II ocorrem apenas
disjunções de cromátides.
 19

Mediante a compreensão de como funciona o processo da mitose e da

meiose podemos constatar que qualquer erro em um desses processos poderá
ocasionar as não-disjunções e com isso provocar, por exemplo, as cromossopatias.
Diante do conceito prévio, ao observamos uma fecundação de um espermatozóide
com um óvulo, forma-se uma única célula, em que passará a se dividir para a
formação de um embrião. Pensando que essa célula que está se dividindo para
formar um embrião acontece de ocorrer uma não-disjunção do cromossomo azul
(mostrado em slide), permanecendo uma célula com 3 cromossomos (2 azuis + 1
vermelho), já a outra célula apenas 1 cromossomo vermelho. Será possível
constatar que haverá células normais e alteradas, sendo considerado um indivíduo
mosaico - condição genética em que um indivíduo recebe dois materiais genéticos
diferentes provindos do mesmo zigoto. O mosaicismo é uma das explicações para a
síndrome de Down, em que parte das células apresenta trissomia do 21 e outra
parte tem a quantidade normal de cromossomos, sendo considerada uma forma rara
da síndrome de Down.
Na meiose I e II, sendo que a meiose I refere-se as não-disjunções dos
cromossomos, enquanto a meiose II refere-se as não-disjunções das cromátides
segue-se o mesmo padrão. Um exemplo, é a ausência de um cromossomo X
caracterizada por um tipo de aneuploidia denominada por síndrome de Turner, esse
indivíduo nascerá uma pessoa do sexo feminino, as quais terão algumas
características específicas como: baixa estatura, pescoço curto e alado, puberdade
tardia, infertilidade, malformações cardíacas, entre outras.
As cromossopatias numéricas podem ser do tipo euploidia (ex: 3N, 4N, 5N),
em que ocorrerá a alteração do genoma, portanto, uma alteração de todos os 23
pares. Esse tipo de alteração é incompatível com a vida – o bebê será abortado.
Agora, uma aneuploidia refere-se a uma alteração cromossômica numérica,
caracterizada pela presença de cromossomos a mais ou a menos no cariótipo,
dentre elas há a síndrome de Down- trissomia do 21, síndrome de Turner – ausência
do X, Síndrome de Klinefelter- presença de um X a mais.
Fora essas comossopatias numéricas, há também as estruturais ocasionadas
pela deleção- chi Du chat, inversão- hemofilia, duplicação- charcot marrie e por
translocação- síndrome de Down. Esta última é considerada outra forma rara da
síndrome de Down, sendo a única forma de ser repassada de geração em geração
(as demais formas acontece totalmente ao acaso). A translocação mais comum é t
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(14; 21), na qual o fragmento do cromossomo 21 adicional é ligado ao cromossomo

14. Quando um dos pais (geralmente a mãe), que possui uma translocação (14; 21)
é capaz de passar essa translocação para seu filho, isso resultará em 3
cromossomos 21(2 herdados pela mãe e 1 herdado pelo pai), desencadeando a
trissomia do 21. Por fim, a última forma de síndrome de Down é através da trissomia
livre do 21 a mais conhecida que se refere a presença de 3 cromossomos 21 ao
realizar o cariótipo.
A realiza-se uma avaliação genotóxica, esta submeterá um material biológico
a um agente ambiental e se verificará se essa exposição terá um poder de alteração
dessas células. Os materiais capazes de ser feito a análise são em células de
meiose e mitose, sendo que a meiose as únicas células possíveis são: óvulos e
espermatozóides, enquanto que na mitose- consegue-se estudar em células que tem
divisão rápida como: raiz da cebola, que contém o meristema apical, antera da
tradescantia pallida, peixe e rato.
O treinamento na observação das fases da mitose tem por objetivo
proporcionar a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos em cada fase,
a fim de identificar possíveis modificações que podem levar a cariótipos anormais.

Objetivo
Observar as fases da mitose em meristema apical de cebola

Procedimento

1. Colocou-se uma cebola em recipiente contendo água para o crescimento das

raízes por 48h;
2. Posteriormente, realizou-se o processo de retirada das raízes e lavou essas
raízes com água destilada;
3. Inseriram-se as raízes em um tudo de ensaio contendo corante;
4. Subsequentemente, o tudo de ensaio contendo as raízes com o corante foi
aquecido- para otimização do processo de coloração;
5. Após o aquecimento, aguardou-se por 7 minutos;
6. Decorrido este tempo, deve-se colocar uma das raízes sobre uma lâmina
limpa e separar os 2-3 mm apicais (tecido meristemático), desprezando o
resto da estrutura;
 21

7. Deve-se juntar 1 gota de corante sobre o meristema seccionado e, com muito

cuidado, cobrir o material com a lamínula;
8. Esmagar então com os polegares apoiados sobre a lamínula coberta com o
papel filtro;
9. Com um lápis, bater suavemente a preparação para se obter uma extensão
unicelular;
10. Com um pedaço de papel filtro, eliminar o excesso de corante;
11. Observar ao microscópio óptico, em objetiva de 40.

A. Cebola em recipiente contendo água para o crescimento das raízes

mantidas por 48h; B. Preparação da lâmina para observar ao microscópio
óptico, em objetiva de 40; C. Visualização em microscópio óptico das fases da
mitose em meristema apical de cebola

Discussão

1. Que fase(s) da mitose deveria(m) ser escolhida(s) caso se necessitasse

determinar o número de cromossomos de uma dada espécie?
A citogenética baseia-se na análise dos cromossomos da célula em divisão,
em particular, na metáfase da mitose, que é a fase em que os cromossomos estão
no grau máximo de espiralização, o que facilita a sua melhor visualização ao
microscópio. Além disso, é nessa fase que os cromossomos estão alinhados no
plano equatorial da célula, o que facilita a contagem e a observação individual de
cada cromossomo. Portanto, a melhor escolha para determinar o número de
cromossomos de uma dada espécie seria a Metáfase da mitose, já que nesta fase é
que ocorre à determinação e visualização do cariótipo, que é uma técnica que se
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baseia na determinação do número e a estrutura dos cromossomos de um

organismo.

2. Dê um laudo (doença, alteração, interpretação do resultado) para os

seguintes cariótipos, Obs: Seguir a nomenclatura oficial para as
mutações cromossômicas:

a)
- Cariótipo normal
O cariótipo normal em humanos é caracterizado pela presença de 46
cromossomos em cada célula do organismo, sendo 22 pares cromossomos
autossômicos e 1 par de cromossomos sexuais. Portanto, pode-se constatar que
este cariótipo é considerado normal em termos de número e estrutura
cromossômica, ou seja, indica que a pessoa tem 46 cromossomos. Para homens –
no caso desse cariótipo em específico - significa que eles têm um cromossomo
sexual X e um cromossomo sexual Y, o que determina o sexo biológico masculino.
Cariótipo: 46,XX (para mulheres)
46,XY (para homens)

b)
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- Trissomia do 21 - Síndrome de Down (47, XY+21)

É uma aneuploidia trissômica que pode afetar tanto indivíduos do sexo
masculino quanto indivíduos do sexo feminino – neste caso em específico refere-se
ao sexo masculino XY. Os indivíduos portadores dessa síndrome possuem um
cromossomo autossômico extra- esse cromossomo extra ocorre no cromossomo 21,
por isso essa doença é também conhecida por trissomia do cromossomo 21. Isso
acarretará para o indivíduo um total de 47 cromossomos. Essa trissomia ocorre
devido a um erro durante a gametogênese masculina ou feminina. Assim, o
espermatozoide ou o óvulo já apresentam a má formação cromossômica antes da
fecundação. Essas alterações podem surgir na gametogênese, durante o crossing-
over da meiose.
Cariótipo: 47, XX+21 (para mulheres)
47, XY+21 (para homens)
Os portadores dessa síndrome apresentam diversas características e sintomas,
porém, podendo ser destacado:
• Baixa estatura;
• Hipotonia - diminuição do tônus muscular;
• Rosto arredondado;
• Olhos oblíquos - semelhantes aos dos orientais;
• Pescoço curto e grosso;
• Orelhas pequenas;
• Mãos pequenas com dedos curtos e prega palmar única.

c)
- Síndrome de Klinefelter – 47,XXY
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É uma aneuploidia trissômica que afeta exclusivamente o sexo masculino,

também pode ser chamada de trissomia dos cromossomos sexuais. Os indivíduos
portadores dessa síndrome possuem um cromossomo X a mais, isto é, condição
genética caracterizada pela presença de uma cópia extra do cromossomo X em
indivíduos do sexo masculino.
Cariótipo: 47, XXY
Os portadores dessa síndrome apresentam diversas características e sintomas,
porém, podemos destacar:
• Estatura elevada;
• Testículos atrofiados;
• Ginecomastia- desenvolvimento de mamas;
• Pelos faciais e corporais reduzidos;
• Distribuição de gorduras corporais que seguem o padrão feminino;
• Hipogonadismo (função testicular reduzida);
• Não produzem espermatozóides (azospermia), sendo inférteis.

3. Escolha uma doença de seu interesse (que não seja as mesmas

descritas na pergunta 2) em que a causa pode ser devido a não-
disjunção meiótica ou mitótica. Descreva a prevalência, os sintomas e
tratamentos. Adicione o cariótipo.

A síndrome Cri-du-chat- também chamada de deleção 5p ou monossomia 5p-

é uma doença genética causada por uma deleção terminal ou intersticial do braço
curto do cromossomo 5. Os pacientes demonstram variabilidade tanto fenotípica
quanto genotípica.
A incidência está entre 1/15.000 e 1/50.000 nascidos vivos, com uma
prevalência maior para mulheres (66%) do que para homens. Para pacientes com
deficiência intelectual a prevalência é de 1,5/1.000, já aqueles pacientes que
procuram aconselhamento genético e são analisados citogeneticamente a
prevalência passa a ser de 1/305.
As características da síndrome Cri-du-chat são: voz aguda que imita o choro
de um gato ao nascer, baixo peso ao nascer, microcefalia, atraso no crescimento,
retardo neuromotor grave e dismorfismo facial, incluindo hipertelorismo, ponte nasal
larga, pregas epicânticas, fissuras palpebrais inclinadas para baixo, baixas orelhas
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postas e retromicrognatia. Além disso, anormalidades cardíacas, neurológicas,

geniturinárias, gastrointestinais e oculares foram relatadas nesta síndrome.
As características fenotípicas da síndrome variam entre os pacientes com
diferentes pontos de ruptura e tamanhos de deleção. As regiões críticas da síndrome
são 5p15.2 e 5p15.3, sendo que a deleção de 5p15.3 é a responsável pelo típico
choro de gato e atraso na fala, enquanto a deleção de 5p15.2 é a responsável por
características dismórficas, microcefalia e deficiência intelectual. Por fim, deleções
maiores estão associadas ao comprometimento neurológico mais grave.
O tratamento da síndrome de Cri-du-Chat é de suporte – essa patologia não
há cura- portanto, a terapia precoce é importante para promover e melhorar o
desenvolvimento físico e psicológico do indivíduo. Dentro destes métodos incluí-se a
introdução precoce de rotinas saudáveis, integração em programas didáticos e a
implementação de programas de reabilitação (fisioterapia, fonoaudiologia,
psicologia). No sentido de amenizar distúrbios comportamentais, aumentar o
desenvolvimento motor e proporcionar uma maior autonomia e adaptação social
desses indivíduos.

Referências

ALKAYA, D.U.; KARAMAN, B.; TÜYSÜZ, B. Three Offspring with Cri-du-Chat

Syndrome from Phenotypically Normal Parents. Mol Syndromol. Jun;11(2):97-103,
2020. doi: 10.1159/000506892.

HOLLAND, P.; WILDHAGEN, M.; ISTRE, M.; REIAKVAM, O.M.; DAHL, J.A.;
SØRAAS, A. Cri du chat syndrome patients have DNA methylation changes in genes
linked to symptoms of the disease. Clin Epigenetics. Oct 14;14(1):128, 2022. doi:
10.1186/s13148-022-01350-3.