UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA E EVOLUÇÃO

RELATÓRIO LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

AULA 2: EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO

Discentes:
Grupo 4
Ana Caroline Reis de Camargo RA: 770438
Caroline Santos de Oliveira; RA: 790987
Gabriela Siviero Erra; RA: 800807
Giovana Martins Campos Simioni ; RA: 801049
Isabella Vitória Alonso; RA:794824
Letícia Piazentin Dantas; RA: 791005
Natália Ribeiro Crispim; RA: 790706

Docentes:
Profa. Dra. Andrea S. da C. Fuentes
Prof. Dr. Iran Malavazi

São Carlos
2023
 SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................3
2. OBJETIVOS.....................................................................................................................5
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................5
3.1 Materiais................................................................................................................... 5
3.2 Metodologia.............................................................................................................. 6
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES....................................................................................7
5. CONCLUSÃO.................................................................................................................. 8
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................8

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1. INTRODUÇÃO
Em experimentos realizados ao longo do século XX, como o experimento de Griffith e
o de Avery, o DNA foi confirmado como a molécula da hereditariedade, onde a informação
genética dos organismos está contida. Desta forma, o estudo do DNA passou a ser de grande
importância, a fim de se entender sua estrutura, suas funções e seus impactos não só no
organismo, mas na pesquisa como um todo. Para possibilitar e facilitar tais estudos, foram
desenvolvidas técnicas para extrair o DNA de dentro das células e posteriormente isolá-lo das
demais organelas e moléculas.
Para que seja possível acessar o DNA, as membranas celulares devem ser degradadas,
bem como a parede celular, quando esta existir. Este procedimento é realizado de formas
mecânicas e químicas, com o uso de técnicas e reagentes diversos, que são escolhidos de
acordo com fatores como o rendimento de material genético esperado, o equipamento
disponível no laboratório, custo-benefício, e em como o DNA purificado será usado, o que
justifica o grau de qualidade e pureza necessários ao final do procedimento. Além disso, as
amostras usadas para a extração podem variar, como tecidos, sangue e folhas. Por exemplo,
algumas células vegetais necessitam de processamento manual para o rompimento de sua
parede celular, feito a partir de maceração com nitrogênio líquido (Bonato, 2008).
Um dos métodos mais populares de obtenção de DNA genômico, devido sua
simplicidade e eficiência, é a extração a partir de fenol-clorofórmio. Inicialmente, a célula é
lisada, como citado anteriormente, a depender do tipo de célula, de modo a liberar no meio
todos os componentes internos das células, juntamente com seus resíduos de degradação
membranar. Para separar todos esses componentes intracelulares das moléculas de interesse,
segue-se a etapa de precipitação, que consiste em centrifugar a amostra, uma vez que os
elementos mais densos, como as organelas, se depositam no fundo, e no sobrenadante restam
DNA, RNA e proteínas.
Em seguida, para as etapas iniciais de purificação do ácido desoxirribonucleico, o
fenol é utilizado para desnaturar as proteínas e remover os contaminantes da solução aquosa
de DNA, entretanto, por ser um composto tóxico, sua remoção residual também se faz
necessária, e ocorre por meio da adição de clorofórmio, que o neutraliza e possui, além, a
importante função de evitar a formação de espuma no meio. Com isto, há a formação de
diferentes fases orgânicas, que devem ser separadas. Um componente que auxilia na
precipitação do DNA e sua separação das demais moléculas é o etanol 95% e 75%, uma vez
que o DNA é insolúvel em álcool, de modo que com algumas lavagens, o produto de interesse
fica contido em um pellet, enquanto os demais são descartados no sobrenadante com etanol.
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Além disso, a adição de sal, como citrato de sódio, ajuda a manter as proteínas dissolvidas no
meio líquido e evita que elas precipitem juntamente ao DNA, pois o sal é responsável por
neutralizar as cargas de DNA e proteínas, separando-as. Ao final do processo, a molécula
deve se manter íntegra, podendo ser armazenada com água ou EDTA, um agente quelante que
impede a ação de DNAses. É importante ressaltar que, como mencionado, a escolha do
método e do armazenamento depende de muitos fatores, porém, é importante que sempre
sejam seguidas as boas práticas laboratoriais.
Para que seja possível observar e conferir se a extração foi bem sucedida, é possível
realizar uma eletroforese. Esta técnica se utiliza de corrente elétrica, forças eletroforéticas e
eletroendosmóticas para promover a separação de moléculas carregadas, como ácidos
nucleicos e proteínas. Seus fundamentos originaram-se a partir dos estudos realizados por
Michaelis em 1909, que observou a movimentação e separação de proteínas a partir do
estímulo gerado por um campo elétrico (Burtis & Ashwood, 2001). Atualmente, são
utilizados dois tipos de eletroforese, em que no primeiro as moléculas percorrem o espaço
através de poros presentes no meio utilizado, como por exemplo o gel de agarose, enquanto
no segundo a migração molecular ocorre através de um tubo capilar.
Para que o processo de eletroforese convencional aconteça, é necessário a presença de
um meio poroso, podendo ser o gel de agarose ou poliacrilamida, além da criação de um
potencial elétrico por meio de dois pólos: um positivo e outro negativo. Esse potencial será
responsável pela migração das moléculas no decorrer do gel, gerando bandas proporcionais ao
tamanho e peso dos fragmentos ali presentes (Oliveira et al., 2015). Ademais, é importante
que exista um marcador de peso molecular, ou ladder, que são fragmentos de DNA de
tamanho conhecido e serão utilizados como referência para a análise dos resultados.
Tal mecanismo necessita também de um preparo específico da amostra para que seja
posicionada de forma correta e seja visível no final do processo. Sendo assim, é fundamental
a adição de um tampão de carreamento, que dará a densidade necessária para que a amostra se
aloje no “pocinho” destinado a ela, ou seja, uma pequena abertura no gel, e permitirá o
monitoramento da migração ao longo do percurso. Além disso, adiciona-se também uma
substância conhecida como corante de DNA, ou fluoróforo, podendo ser o brometo de etídeo.
O fluoróforo quando associado ao DNA dupla fita emite altos níveis de fluorescência, o que
permite a análise dos resultados obtidos durante o processo.

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2. OBJETIVOS
Compreender os princípios que envolvem o processo de extração de DNA genômico a
partir do tecido vegetal e as etapas pertencentes a ele, além da função do TRIzol durante o
decorrer da atividade. Ademais, objetiva-se atingir conhecimentos práticos em relação ao
procedimento de eletroforese, visto que a técnica é amplamente utilizada dentro da rotina
laboratorial.
Por fim, espera-se que a amostra de DNA coletada se mostre eficiente tanto em
qualidade como em quantidade, de forma a possibilitar a análise após passar pelo processo de
eletroforese.

3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- Pipetas
a. p1000
b. p100
c. p20
d. p2
- Folhas de plantas
- Almofariz
- Pilão
- Nitrogênio líquido
- Eppendorf 1,5 ml
- Clorofórmio
- Etanol 70%
- Etanol 95%
- Citrato de sódio 0,1 M
- Gel de agarose 1%
e. TAE 1X 30 ml
f. agarose 0,3 g
- Tampão de amostra: Blue Green Loading Dye
- Erlenmeyer

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3.2 Metodologia
Primeiramente, foi feita a transferência de uma pequena quantidade de folhas (material
vegetal) para um almofariz. Em seguida, adicionou-se nitrogênio líquido para pulverizar as
folhas com a ajuda de um pilão até que o material se transformasse em pó. Posteriormente, de
maneira rápida, com o auxílio de uma espátula, o material obtido foi transferido para um tubo
Eppendorf de 1,5 mililitros (mL) até atingir a marca de 100 μL. Logo após, acrescentou-se 1
mL de TRIzol ao tubo e homogeneizou-se o conteúdo, seguido por um período de incubação
de 3 minutos em temperatura ambiente. Após esse intervalo, o tubo foi levado até a capela,
onde adicionaram-se 200 μL de clorofórmio, seguido de mais um período de incubação de
aproximadamente 4 minutos.
Em seguida, a amostra foi levada à centrífuga por 15 minutos a 12000 rotações por
minuto (rpm), resultando na diferenciação do conteúdo do tubo em três fases (camadas).
Utilizando uma pipeta, o líquido superior foi removido e descartado, enquanto o conteúdo
presente na fase intermediária foi transferido para um novo tubo, pois continha o DNA. O
conteúdo restante foi descartado. O tubo contendo o material coletado na etapa anterior foi
levado para a centrífuga por 10 minutos a 12000 rpm, o que permitiu a separação da fase
orgânica (parte inferior) da fase aquosa (parte superior). A fase aquosa foi coletada e
transferida para um novo tubo Eppendorf de 1,5 mL, ao qual acrescentaram-se 300 μL de
etanol 95%. O tubo foi invertido e incubado por 3 minutos à temperatura ambiente na
bancada. Após a incubação, a amostra foi centrifugada por 10 minutos a 5000 rpm, e ao final
desse período, o sobrenadante foi descartado.
Na fase seguinte, que corresponde à etapa de lavagem, adicionou-se 500 μL de citrato
de sódio 0,1 M à amostra para ressuspender o pellet, e o tubo foi incubado por 30 minutos à
temperatura ambiente, com inversões eventuais. Após esse procedimento, a amostra foi
novamente centrifugada por 10 minutos a 5000 rpm, e o novo sobrenadante foi descartado.
Posteriormente, acrescentaram-se 500 μL de etanol 75% à amostra e, em seguida, a
centrifugação continuou por mais 10 minutos a 5000 rpm. Depois, o sobrenadante foi
novamente descartado, e o precipitado passou pelo processo de secagem, invertendo o tubo
Eppendorf em um papel-toalha por 5 minutos à temperatura ambiente. Por fim, o precipitado
foi dissolvido em 20 μL de água esterilizada e mantido a 42ºC por 10 minutos.
Quanto à preparação do gel de agarose, fez-se um gel com concentração de 1%,
combinando-se 30 mL de tampão TAE 1X (Tris-Acetato-EDTA) com 0,3 g de agarose em um
frasco Erlenmeyer. A mistura foi aquecida em intervalos de 30 segundos no micro-ondas até
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que a agarose estivesse completamente dissolvida. Após o resfriamento da solução e a adição
de 1 μL de brometo de etídio, o gel foi vertido na cuba para permitir a polimerização da
matriz de agarose. Após a solidificação da matriz, acrescentou-se o tampão TAE 1X para
imergir o gel.
Para o procedimento de aplicação da amostra de DNA genômico no gel, cada grupo
foi responsável por realizar essa etapa. Inicialmente, adicionou-se 12 μL da amostra de DNA
em um novo tubo, e em seguida 2 μL de tampão de amostra. Após homogeneizar a mistura
para facilitar a visualização, uma vez que o tampão a tornava azul, aplicaram-se 14 μL em um
poço do gel. Depois que todas as amostras foram aplicadas, a cuba de eletroforese foi fechada
e os cabos condutores à fonte de eletroforese foram conectados, garantindo que os ânodos
estivessem emparelhados entre si, assim como os cátodos. A fonte foi ligada e ajustada para
100 volts, dando início ao processo de separação por eletroforese, que durou
aproximadamente 30 minutos. Em seguida, a fonte foi desligada, os cabos foram
desconectados e o gel foi examinado no transiluminador.

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
O perfil eletroforético foi visualizado após a aula, a partir de uma imagem
disponibilizada pela professora. A aplicação da amostra de DNA no gel de agarose foi
realizada por um membro de cada grupo, previamente definidos para realizar os experimentos
em aula. Todas as amostras feitas em aula foram aplicadas no mesmo gel.

Imagem 1. Resultado da eletroforese contendo amostras de DNA. A banda destacada em vermelho representa a
região onde foi aplicada a amostra do grupo. Fonte: autoria própria.

A amostra foi aplicada no 4º poço do gel de agarose, sendo os resultados relacionados

à formação das bandas considerados satisfatórios. A banda formada após a eletroforese é

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relativamente nítida, indicando um nível de integridade da amostra de DNA coletada.
Entretanto, para o experimento em questão, é esperada uma maior nitidez do que a obtida pelo
grupo, podendo significar que parte da amostra sofreu deterioração durante o processo de
preparação.

5. CONCLUSÃO
O experimento realizado se mostrou em grande parte efetivo, visto o objetivo de se
obter conhecimentos relacionados à extração do DNA genômico, envolvendo as etapas de
lise, precipitação e lavagem. O entendimento sobre o papel do TRIzol para a lise celular, o
auxílio que ele fornece para manter a integridade da amostra e também possibilitar separação
do DNA dos demais componentes. Além da experiência prática em lidar com o processo de
eletroforese.
Porém, a amostra obtida por meio do experimento não se mostrou muito eficiente,
formando apenas uma pequena banda visível após passar pela eletroforese, isso pode ter
ocorrido devido a uma degradação mais intensa durante algum passo do processo. Embora o
resultado não tenha sido como o esperado, o experimento como um todo permitiu que
diferentes processos fossem abordados, tornando-o muito interessante do ponto de vista
didático.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDEL-LATIF, Amani; OSMAN, Gamal. Comparison of three genomic DNA extraction methods to
obtain high DNA quality from maize. Plant Methods, v. 13, n. 1, p. 1-9, 2017.

BONATO, A. L. V. Extração de DNA genômico de cereais de inverno na Embrapa Trigo. Passo

Fundo: Embrapa Trigo, 2008. 11 p. html. (Embrapa Trigo. Comunicado técnico online, 235).
Disponível em: <http://www.cnpt.embrapa.br/biblio/co/p_co235.htm>

BURTIS, C. A.; ASHWOOD E. R. Tietz, Fundamentals of Clinical Chemistry 5th Ed., 2001.
de Oliveira, E., Trentin, T. de C., Camargo, F., Pinto, YDP, & Martins, DB (2015). ELETROFORESE:
CONCEITOS E APLICAÇÕES. Enciclopédia Biosfera , 1129–1149.

OLIVEIRA, M. C. de S. Fundamentos teórico-práticos e protocolos de extração e de amplificação de

DNA por meio de reação de cadeia da polimerase. Recurso eletrônico, Embrapa Pecuária Sudeste,
São Carlos, 2007. Disponível em:
<https://www.alice.cnptia.embrapa.br/bitstream/doc/48295/1/LivroProtMolecular.pdf> . Acesso em:
24 out. 2023.

PEREIRA, L DA S. Extração de DNA. Aula prática. Universidade Federal de Pelotas, RS.

Disponível em:
<http://www2.ufpel.edu.br/biotecnologia/gbiotec/site/content/paginadoprofessor/uploadsprofessor/588
54cbdc608b14219089d921026b558.pdf >. Acesso em: 26 out. 2023.