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Discentes:
Grupo 4
Ana Caroline Reis de Camargo; RA: 770438
Caroline Santos de Oliveira; RA: 790987
Gabriela Siviero Erra; RA: 800807
Giovana Martins Campos Simioni; RA: 801049
Isabella Vitória Alonso; RA: 794824
Letícia Piazentin Dantas; RA: 791005
Natália Ribeiro Crispim; RA: 790706
Docentes:
Profa. Dra. Andrea S. da C. Fuentes
Prof. Dr. Iran Malavazi
São Carlos
2023
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................................3
2. OBJETIVOS.....................................................................................................................4
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................4
3.1 Materiais................................................................................................................... 4
3.2. Métodos.................................................................................................................... 5
3.2.1. Reação de Ninidrina...................................................................................... 5
3.2.2. Determinação utilizando o reagente de Biureto.......................................... 6
3.2.3. Determinação utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau.......................... 6
3.2.4. Reação xantoproteica.....................................................................................7
3.2.5. Precipitação irreversível................................................................................7
3.2.5.1. Desnaturação pelo calor....................................................................... 8
3.2.5.2. Desnaturação por ácidos...................................................................... 8
3.2.5.3. Desnaturação por metais pesados........................................................8
3.2.5.4. Desnaturação por solventes orgânicos................................................ 8
3.2.6. Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas.......................8
3.2.6.1. Solubilização por “salting-in”.............................................................. 9
3.2.6.2. Precipitação por “salting-out”........................................................... 10
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES..................................................................................10
4.2.1. Reação de Ninidrina.................................................................................... 10
4.2.2. Determinação utilizando o reagente de Biureto........................................ 11
4.2.3. Determinação utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau........................ 12
4.2.4. Reação xantoproteica...................................................................................14
4.2.5. Precipitação irreversível..............................................................................15
4.2.5.1. Desnaturação pelo calor..................................................................... 15
4.2.5.2. Desnaturação por ácidos.................................................................... 16
4.2.5.3. Desnaturação por metais pesados......................................................17
4.2.5.4. Desnaturação por solventes orgânicos.............................................. 18
4.2.6. Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas.....................21
4.2.6.1. Solubilização por “salting-in”............................................................ 21
4.2.6.2. Precipitação por “salting-out”........................................................... 22
5. CONCLUSÃO................................................................................................................ 23
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................24
2
1. INTRODUÇÃO
A estrutura primária de proteínas está associada à presença de 20 monômeros
diferentes combinados de diversas formas, denominados aminoácidos. Estes aminoácidos,
quando ligados através de ligações peptídicas, recebem o nome de proteína, e atuam em
múltiplas funções do organismo, desde formação de estruturas até replicação de material
genético. Os estudos associados à estrutura química de aminoácidos vem sendo realizado
desde a antiguidade, dada toda a importância e oportunidades associadas ao conhecimento
e elucidação de formações proteicas. Os aminoácidos são compostos por um carbono
denominado α, que faz ligações com um grupamento amina (NH2), um grupamento
carboxila (COOH), uma molécula de hidrogênio e um grupamento que diferencia as
moléculas, chamado de grupamento R (Walsh, 2014).
Para estudos de proteína, é necessário remover as proteases que estão presentes na
amostra, a fim de obter a proteína isolada de forma íntegra sem que ocorra degradação
desta, de preferência rapidamente ao início do procedimento. A precipitação de proteínas
para a purificação deve ser realizada de forma delicada e cuidadosa, porém eficiente e de
maneiras econômicas, para que seja possível replicar o processo quantas vezes forem
necessárias sem grandes gastos. Além da separação das proteases, a precipitação de
proteínas possibilita que estas se acumulem em maiores concentrações, aumentando a
eficácia do isolamento. Ao decorrer dos anos, com o desenvolvimento de estudos, diversas
formas de precipitação de proteínas foram desenvolvidas, variando de acordo com as
propriedades específicas das proteínas que estão sendo estudadas e suas interações com
outros componentes (Burgess, 2009).
No geral, essas formas podem ser divididas em reações de precipitação
irreversíveis e reações de precipitação reversíveis. As reações de precipitação irreversíveis
se baseiam na desnaturação das estruturas tridimensionais das proteínas por métodos
físico-químicos, como a diferença de temperatura e pH, além da possível formação de
complexos insolúveis com metais pesados ou desidratação por solventes orgânicos.
Entretanto, tais métodos não são indicados para estudos estruturais ou funcionais das
proteínas, visto que estes dependem da tridimensionalização das moléculas; porém, podem
ser empregados na sua quantificação. Já as reações reversíveis são indicadas para tais
finalidades, uma vez que podem atingir a separação das proteínas sem modificar
definitivamente suas estruturas e funções.
Um exemplo de precipitação de proteínas é a reação de ninidrina, um método
utilizado para quantificar proteínas ou identificar componentes em alimentos, fármacos, e
3
outros. O uso desta reação se baseia na reação da ninidrina com o α-amino livre dos
aminoácidos. A detecção se inicia quando a ninidrina realiza um ataque nucleofílico a
aldeídos e cetonas, adicionando um nitrogênio e formando uma imina. Por conta da
presença de um grupo carboxilato associado ao carbono α do aminoácido, ocorre uma
descarboxilação. A substância que é produto desta reação é capaz de realizar uma ligação
com outra molécula de ninidrina, formando como produto uma imina, que apresenta uma
coloração violeta.
A velocidade da reação é relativamente alta, apresentando um resultado eficiente
sobre a concentração dos compostos localizados na amostra através de uma análise de cor.
Ainda, pode reagir de forma distinta para com aminoácidos que apresentam amina
secundária, como a prolina, formando enamina ao invés de uma imina e se tornando
incapaz de reagir com outras moléculas de ninidrina, apresentando uma coloração
amarelada distinta do tom violeta presente em aminoácidos com apenas um α-amino livre
(Yemm, 1955).
2. OBJETIVOS
O relatório tem como objetivo aprofundar o conhecimento sobre algumas das
principais reações empregadas na análise de proteínas, visando compreender os princípios
fundamentais que sustentam esses métodos. Além disso, pretende-se investigar o impacto
da precipitação de proteínas, abordando tanto os processos reversíveis quanto irreversíveis,
e identificar os principais agentes químicos e físicos que desempenham papéis cruciais
nesses processos. Por fim, busca-se identificar os grupos reativos presentes nas proteínas e
aminoácidos.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Materiais
- Pipetas
a. p1000
b. Graduada de 10 mL
- Pipetador Pi-Pump
- Tubos falcon (15 mL)
- Soro diluído (1:3)
- (NH4)2SO4 saturado (4 mol/L)
- (NH4)2SO4 sólido
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- Água destilada
- NaOH (2 mol/L)
- CuSO4 (0,5%)
- Béquer
- Bastão de vidro
- NaCI (1 mol/L)
- Solução de ovoalbumina (1:3)
- Solução de ovoalbumina (1:1)
- Vórtex
- Banho-maria
- TCA (20%)
- HNO3 (2 mol/L)
- AgNO3 (1 mol/L)
- Acetona 100%
- Etanol absoluto
3.2. Métodos
3.2.1. Reação de Ninidrina
Foram adicionadas em tubos de ensaio 2 mL de água destilada, 2 mL de glicina 0,1
mol/L, 2 mL de histidina 0,1 mol/L, 2 mL de prolina 0,1 mol/L e 2 mL de solução de
ovoalbumina (1:3), sendo cada amostra adicionada em um tubo distinto, enumerados,
respectivamente, 1, 2, 3, 4 e 5. Em cada um dos tubos preparados, foram adicionadas 5
gotas de ninidrina. A tabela abaixo, presente no protocolo de experimento, ilustra o
conteúdo dos tubos:
5
Em seguida, os tubos foram homogeneizados em agitação com vórtex, e
posteriormente depositados em banho maria fervente por um período de duração de 2
minutos. Por fim, as cores das amostras foram observadas e documentadas.
6
Todas as adições foram realizadas lentamente, e depois de cada tubo conter todos
os componentes indicados, foi realizada a agitação dos mesmos no vórtex para que fosse
possível analisar a coloração apresentada por cada um.
Para cada um dos tubos, com exceção do tubo 15, foram acrescentados 0,25 mL de
ácido nítrico (HNO3) concentrado e 2 mL de água. Os tubos foram submetidos à fervura
em banho-maria por um período de 2 minutos. Após o resfriamento dos tubos, 0,25 mL de
NaOH 12 mol/L foi adicionado gota a gota com o auxílio de uma pipeta P1000. Em
seguida, as soluções foram cuidadosamente misturadas e as cores observadas em cada tubo
foram registradas.
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3.2.5.1. Desnaturação pelo calor
Esta reação foi montada no tubo de ensaio de número 20, no qual pipetou-se 2 mL
de ovoalbumina diluída (1:3). O tubo foi incubado no banho fervente por 5 minutos, e o
resultado foi observado após.
8
Nos tubos Falcon 26 e 27, contendo os precipitados I e II, respectivamente, foram
adicionados 2 mL de água destilada; posteriormente, esses tubos foram levados para
ressuspensão no vórtex. No tubo 28, foi utilizado 2 mL do próprio sobrenadante obtido.
Além disso, em um tubo Falcon, adicionou-se 2 mL de água destilada para controle do
experimento (branco).
Para os testes de Biureto, em cada tubo (26, 27, 28, branco), adicionaram-se 2 mL
de NaOH (2 mol/L) e 0,5 mL de CuSO4 (0,5%).
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3.2.6.2. Precipitação por “salting-out”
Primeiramente, 3 mL de clara de ovo (ovoalbumina) foram pipetados e transferidos
para um tubo de ensaio grande (tubo 29). Em sequência, procedeu-se à adição de 5 mL de
solução saturada de (NH4)2SO4 (4 mol/L) ao tubo 29. Após essa etapa, 5 mL de água
destilada foram adicionados ao mesmo tubo, e, com cuidado, realizou-se a inversão do
tubo de forma lenta, permitindo a observação do processo de ressolubilização do
precipitado de proteínas.
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.2.1. Reação de Ninidrina
Ao entrar em contato com outras substâncias, a ninidrina é capaz de detectar a
presença de α-amino livre dos aminoácidos. Na reação, a ninidrina realiza um ataque
nucleofílico a aldeídos e cetonas, adicionando um nitrogênio e formando uma imina. Por
conta da presença de um grupo carboxilato associado ao carbono α do aminoácido, ocorre
uma descarboxilação. A substância advinda desta reação é capaz de adicionar à outra
molécula de ninidrina, formando como produto uma imina, que apresenta uma coloração
violeta.
Nos resultados obtidos pelo grupo, obteve-se com sucesso a presença de tubos com
intensa coloração roxa, sendo a cor proporcional à concentração do produto da reação, com
exceção dos tubos 1, que diz respeito ao tubo de controle, realizado com água destilada, e
o tubo 4, que contém prolina.
Figura 2: Tubos de ensaio contendo resultado de misturas de ninidrina 5 gotas com 2 mL de,
respectivamente: 1. água destilada; 2. glicina (0,1 mol/L); 3. histidina (0,1 mol/L); 4. prolina (0,1 mol/L); 5.
solução de ovoalbumina (1:3). Fonte: Imagem autoral.
10
A coloração amarelada no tubo 4 se dá pela diferença estrutural da prolina em
relação aos outros aminoácidos utilizados no experimento, pois este aminoácido é uma
amina secundária, formando uma enamina. A enamina é incapaz de reagir com outra
molécula de ninidrina, mantendo sua própria coloração, que é amarelada.
Figura 3: Complexo formado entre o cobre II e peptídeos ou proteínas. Fonte: (Barreiros, André, 2015)
11
amostra apresentou a cor violeta após o contato com o sulfato de cobre, como pode ser
visto na figura.
As amostras 8, 9 e 10, em contato com apresentaram uma cor azulada, como pode
ser observado na imagem 4. Os tubos de ensaio 8 e 9 continham aminoácidos, glicina e
tirosina, respectivamente, visando que só há a formação de complexo de cobre em ligações
peptídicas, vale ressaltar que aminoácidos não apresentam estas ligações, ademais, os
grupos amino livres não coordenam com o cobre, pois em pH 7,0 encontram-se protonados
na forma de -NH3+, não tendo elétrons disponíveis para doar. O controle negativo, tudo de
ensaio 10, como esperado, também não apresentou formação de complexo, mantendo
assim uma coloração azulada. Destarte, o resultado do experimento foi satisfatório.
12
responsável por reduzir o reagente de Folin-Ciocalteau, gerando óxido de tungstênio
(W8O23) e óxido de molibdênio (Mo8O23), que possuem coloração azul detectável dentro
do espectro de 760 nm. Sendo assim, quanto mais intensa for a coloração azul apresentada,
maior a quantidade de substância redutora no meio, essa característica é essencial para a
quantificação dessas substâncias através da análise espectrofotométrica.
É importante ressaltar que a adição de NaOH proporcionou um caráter básico para
o meio, tornado-o mais estável para que a reação acontecesse, e assim possibilitando uma
observação mais rápida da conclusão do processo.
Ao realizar a análise dos resultados apresentados pelo experimento, é possível
identificar a coloração azul nos tubos 11 e 12, que continham a tirosina e a proteína
albumina. O fato de existir coloração aponta a presença de componentes fenólicos na
estrutura das substâncias adicionadas em ambos, o que ocasionou a redução do reagente de
Folin.
O tudo de número 13 não apresentou nenhuma coloração, o que indica que a
glicina não é um aminoácido passível de interação com o reagente utilizado. Isso ocorre
pois em sua estrutura não há presença de componentes fenólicos. Sendo assim, esse
resultado é importante para concluir que a reação de Folin-Ciocalteau, apesar de acessível
e relativamente simples de ser realizada, não é efetiva para todos aminoácidos, pois
aminoácidos livres não são capazes de interagir com o reagente.
Por fim, o tubo de número 14, utilizado como controle para o experimento, não
apresentou nenhum tipo de coloração. Tal resultado já era esperado pois o mesmo recebeu
apenas NaOH, água destilada e o reagente de Folin, ou seja, nenhum tipo de substância
capaz de gerar a redução do reagente e consequentemente proporcionar a coloração azul
para o meio.
Figura 5: Tubos de ensaio contendo o resultado do experimento de determinação de proteínas e aminoácidos utilizando
o reagente de Folin-Ciocalteau. Os tubos 11 e 12 apresentam coloração azul intensa, devido a presença de estruturas
fenólicas. O tubo 13, contendo glicina, se manteve translúcido devido a ausência de composto fenólico. Tubo 14,
controle, translúcido pois contém apenas os componentes do reagente. Fonte: imagem autoral.
13
4.2.4. Reação xantoproteica
Após ferver os tubos em banho-maria foram observadas as seguintes colorações (figura 6):
Figura 6: tubos 15, 16, 17, 18 e 19 (esquerda para direita) após etapas da reação xantoproteica. Fonte:
Imagem autoral
14
No tubo 16 nota-se uma cor amarelada também, afirmando que também ocorreu a
reação xantoproteica. Como o tubo possuía o aminoácido tirosina, que possui um anel
benzênico em sua cadeia lateral, já era esperado que ocorresse a mudança de cor. Também
foi notado que o tubo 17 estava com uma cor alaranjada, indicando que ocorreu a reação
assim como no tubo 16. O tubo possuía triptofano, que, como explicado anteriormente,
possui um anel benzênico em sua cadeia lateral. O fato do tubo 17 possuir uma coloração
mais forte do que o tubo 16 pode indicar que a concentração de aminoácidos do tubo 17
estava maior.
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Figura 7. Solução de ovoalbumina após desnaturação pelo calor. Fonte: imagem autoral
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Figura 8. Solução de ovoalbumina após desnaturação por ácidos, sendo que o tubo 21 continha TCA (20%)
e o tubo 22 continha HNO3 (2 mol/L). Fonte: imagem autoral.
17
perturbação leva à desnaturação, além da formação de agregados, que podem ser
observados na Figura 9, que consiste na solução de ovoalbumina após a adição de AgNO3,
que causou sua desnaturação, agregação e turvação.
Figura 9. Solução de ovoalbumina após desnaturação por AgNO3 (1 mol/L). Fonte: imagem autoral.
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penetra na estrutura proteica, e deslocam as moléculas de água que circundam as proteínas
em solução, o que altera o equilíbrio de interações hidrofílicas e hidrofóbicas, responsáveis
por estabilizar a estrutura tridimensional da proteína.
Para entender este procedimento, deve-se considerar a diferença entre as constantes
dielétricas da água e dos solventes. A constante dielétrica é uma medida da capacidade de
um solvente para reduzir a força das interações eletrostáticas entre íons ou cargas elétricas
em solução. A água possui uma constante dielétrica muito alta (D = 80), por ser um
solvente altamente polar capaz de solvatar de maneira eficaz íons e moléculas com cargas
elétricas. Entretanto, a maioria dos solventes orgânicos possuem constantes dielétricas
muito menores, ou seja, são menos polarizados e têm uma capacidade reduzida de
solvatação de cargas elétricas.
Como resultado, as interações eletrostáticas entre as moléculas de proteína não são
efetivamente neutralizadas nos solventes orgânicos, o que pode levar à formação de
agregados proteicos. Esses agregados resultam da atração entre as cargas opostas das
moléculas de proteína, que não são eficazmente separadas e solvatadas pelo solvente
orgânico. Além disso, o efeito hidrofóbico dos aminoácidos também geram impactos na
agregação dessas proteínas. Com isso, ocorre a desnaturação da estrutura proteica, que
formam aglomerados insolúveis e precipitam após a remoção da água de solvatação.
Na Figura 10 pode-se observar os tubos 24 e 25 antes da adição dos solventes
orgânicos, com uma aparência límpida e clara. Já na Figura 11, observa-se o tubo 24 após a
adição do solvente, com aglomerados brancos das proteínas precipitadas. O mesmo
processo ocorreu no tubo 25, apesar de serem solventes diferentes, entretanto, não foram
capturadas imagens.
Figura 10. Solução de ovoalbumina antes da adição dos solventes orgânicos. Fonte: imagem autoral.
19
Figura 11. Solução de ovoalbumina após a desnaturação com solvente orgânico Fonte: imagem autoral.
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retida na porção fenólica da amostra, enquanto o DNA e RNA são retidos na parte aquosa,
o que permite uma fácil separação entre eles.
Figura 13. Béquer contendo clara de ovo e água. Fonte: imagem autoral.
Figura 14. Béquer contendo clara de ovo e água após a adição gota a gota de NaCl. Fonte: imagem autoral.
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introduzidos em altas concentrações, eles retiram a água que envolve as moléculas
proteicas. A alta força iônica resultante então provoca a precipitação das proteínas, em um
fenômeno conhecido como efeito de "salting-out". O experimento em questão comprova
esse efeito ao introduzir 5 mL de clara de ovo em um tubo de ensaio grande (tubo 29) e,
em seguida, adicionar 5 mL de (NH4)2SO4 saturado. Nesse momento, é possível observar
a formação de um precipitado composto por proteínas que não foram desnaturadas.
Posteriormente, ao adicionar 5 mL de água destilada ao mesmo tubo e verter suavemente,
é possível notar a ressolubilização do precipitado de proteínas, conforme ilustrado na
Figura 15.
Figura 15. Tubo de ensaio depois da adição de água. Fonte: imagem autoral.
5. CONCLUSÃO
No experimento 1, o resultado esperado foi alcançado, mostrando que a ninidrina
possui a capacidade de detectar a presença de α-amino livre dos aminoácidos. Essa técnica
foi eficaz e precisa para a determinação de alguns aminoácidos e proteínas, levando em
consideração sua conformação química.
No experimento 2, o resultado foi extremamente satisfatório, comprovando a
eficiência da metodologia de reação de biureto. Essa técnica assegurou a determinação e
qualificação protéica com uma alta sensibilidade e precisão, através da formação de
complexos entre o cobre II e a proteína ou peptídeo.
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Já no experimento 3 se mostrou eficaz para a identificação de compostos fenólicos
no meio, sendo possível uma determinação visual e de fácil compreensão.
O experimento 4 se mostrou funcional, visto que seu objetivo era a determinação
de aminoácidos que possuem anéis aromáticos (benzênico). Através da técnica é possível
a identificação de aminoácidos que possuem esses anéis, sendo assim, uma metodologia de
qualificação.
Quanto ao experimento 5, foi possível observar que as precipitações irreversíveis
são relativamente fáceis de serem visualizadas, e diferentes métodos podem ser
empregados, a depender da necessidade e objetivo do estudo, visto que cada método
emprega um princípio específico para ocorrer.
No experimento 6, embora os resultados não tenham sido perfeitamente
concordantes, o método do biureto mostrou ser uma ferramenta de grande valor na
determinação da concentração de proteínas em soluções altamente salinas. Este método
permitiu a avaliação da precipitação seletiva das proteínas, destacando como as soluções
salinas influenciam a formação de complexos biureto e afetam os níveis de precipitação.
Esta técnica oferece uma abordagem precisa e sensível para a quantificação de proteínas
em contextos complexos.
Além disso, foi observado que a variação das quantidades de sal provocou a
precipitação de proteínas em momentos distintos. Este efeito é resultado da influência nos
diferentes níveis de solvatação causados pela adição de sal, o que resulta na precipitação
inicial das proteínas de maior tamanho. À medida que a concentração de sal aumenta, as
proteínas de menor tamanho também começam a precipitar. Esta diferenciação nos
momentos de precipitação possibilita a aplicação dos métodos de "salting in" e "salting
out" para separar proteínas com base no peso molecular, seja de uma mistura ou de um
extrato bruto. Assim, ao identificar a proteína alvo e consultar fontes confiáveis sobre os
valores ideais de sal para sua precipitação, torna-se viável separar o componente desejado
de uma mistura.
Portanto, pode-se concluir que os experimentos atingiram o seu objetivo de
embasar o conhecimento dos alunos acerca das reações gerais e precipitações de proteínas,
seguindo diferentes métodos.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BURGESS, Richard R. Protein precipitation techniques. Methods in enzymology, v. 463, p.
331-342, 2009.
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Ensaio em microplaca de matéria redutora pelo método do Folin-Ciocalteu para extratos de algas
Janaína S. Pires1 , Priscila B. Torres2 , Déborah YAC dos Santos3 . (nd).
GORNALL AG, BARDAWILL CJ, DAVID MM. Determination of serum proteins by means of
the biuret reaction. J Biol Chem. 1949 Feb;177(2):751-66.
JOUD, A, and TACUSSEL. “Dosage des protides par la réaction dite du biuret”
[Determination of proteins by the so-called biuret reaction]. Annales de biologie clinique vol.
8,4 (1950): 498-500.
25