CENTRO DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE TERESINA – CET

FACULDADE DE TECNOLOGIA DE TERESINA

CURSO DE FARMÁCIA
DISCIPLINA: BIOQUÍMICA BÁSICA
PROFESSOR(A): DANIELLE ZILDEANE SOUSA FURTADO

ANDRESSA DA SILVA SANTOS

CRYSLANE PEREIRA SOUZA

DARLENE CARDOSO DE MENEZES

FRANCISCO AFONSO NETO

FRANCILENE DE JESUS COSTA

JACKELINE DA ROCHA LEAL ALVES

KAUANNE MARINHO COSTA

LEILYANNE LOPES PINTO

ODORICO FRANCO PINTO

RAQUEL AS SILVA CAVALCANTE LIRA

VANESSA DA SILVA SANTOS

PRÁTICA SOBRE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS POR DIFERENTES

MÉTODOS

TERESINA - PI
2023
 2

ANDRESSA DA SILVA SANTOS

CRYSLANE PEREIRA SOUZA

DARLENE CARDOSO DE MENEZES

FRANCISCO AFONSO NETO

FRANCILENE DE JESUS COSTA

JACKELINE DA ROCHA LEAL ALVES

KAUANNE MARINHO COSTA

LEILYANNE LOPES PINTO

ODORICO FRANCO PINTO

RAQUEL AS SILVA CAVALCANTE LIRA

VANESSA DA SILVA SANTOS

PRÁTICA SOBRE PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS POR DIFERENTES

MÉTODOS

Relatório apresentado ao Curso de

Graduação de Bachalerado em
Farmácia com o objetivo de
aprendizagem e prática no laboratório de
Bioquímica Básica.

Orientador(a): Prof.ª Drª. Danielle

Zildeana Sousa Furtado.

TERESINA – PI
 3

2023

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO....................................................................................................4
OBJETIVOS........................................................................................................6
METODOLOGIA.................................................................................................6
CONCLUSÃO.....................................................................................................9
ANEXOS............................................................................................................11
REFERÊNCIAS.................................................................................................20
 4

INTRODUÇÃO

As proteínas são as biomoléculas mais abundantes nos seres vivos e

exercem funções fundamentais em todos os processos biológicos. São
polímeros formados por α‐aminoácidos, unidos entre si por ligações peptídicas.
As proteínas são constituídas de 20 aminoácidos primários diferentes, reunidos
em combinações praticamente infinitas, possibilitando a formação de milhões
de estruturas diferentes (MOTTA, p.30).

As proteínas cumprem papéis importantes para manter a homeostase no

corpo humano. Elas estão organizadas em dois grupos: dinâmicas,
correspondendo a transporte, defesa, catálise de reações, controle do
metabolismo e contração; e estruturais, sendo proteínas como o colágeno e
elastina que promovem a sustentação estrutural da célula e dos tecidos. Além
disso, são precursoras de algumas moléculas, como nucleotídeos, ácidos
nucléicos e a clorofila. Vários α‐aminoácidos ou seus derivados atuam como
mensageiros químicos entre as células, como a glicina, ácido γ‐aminobutírico
(GABA, um derivado do glutamato), serotonina e melatonina (derivados do
triptofano) são neurotransmissores, substâncias liberadas de uma célula
nervosa e que influenciam outras células vizinhas (nervosas ou musculares).

A precipitação de proteínas tem sido estudada principalmente com o uso

de sais neutros, tais como cloreto de sódio (NaCl), sulfato de sódio (N2SO4) e
mais frequentemente usado é o sulfato de amônio (NH4)2SO4 (DOONAN,
2004). Os solventes orgânicos também podem ser empregados para
precipitação e concentração de proteínas (GRODZKI; BERENSTEIN, 2010),
tais como metanol, etanol, butanol e mais comumente utilizada é a acetona, na
preparação de amostras de proteínas para a análise de proteômica, como
espectrometria de massas (SIMPSON; BEYNON, 2010).

Cada grupo possui um mecanismo de ação para precipitação das

proteínas; os sais neutros promovem uma redução na concentração ideal de
água superficial, levando à precipitação conhecida por “salting out” (DUONG-
LY; GABELLI, 2014); enquanto que os solventes orgânicos, através de seus
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grupos polares, interagem com os grupos polares da proteína, presentes na

superfície e região intramolecular de maneira a impedir a hidratação,
resultando na redução da solubilidade e precipitação proteica
(TSCHELIESSNIG et al., 2014).
O emprego da precipitação é uma alternativa na obtenção de proteínas
recombinantes, seja com o uso de sais ou solventes orgânicos, permitindo a
obtenção das proteínas de forma simplificada (JAHIC et al., 2006). Entretanto,
é conveniente verificar se as propriedades antigênicas foram preservadas no
final do processo (SIMPSON; BEYNON, 2010).
O atual relatório teve como principal objetivo o aprendizado e a
observação de métodos que facilitem o entendimento do conteúdo. A partir
disso, serão relatados métodos quem envolvem precipitação de proteínas por
adição de sais neutros (efeito da força iônica), precipitação de proteínas por
adição de sais neutros (efeito da força iônica), precipitação por ação do calor
(desnaturação), precipitação das proteínas por solventes orgânicos.
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OBJETIVOS

 Verificar a presença de proteínas eletricamente carregadas, por meio da

influência do pH e identificar os grupamentos funcionais que permitem a
solubilidade e agentes interferentes deste processo.

METODOLOGIA

PRÁTICA 01 - Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito

da força iônica
1.1 MATERIAIS
 solução de albumina 1g/mL;
 solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4];
 solução de NaCl;
 água destilada;
 01 tubo de ensaio;
 pipetas (vidro ou plástica);

1.2 PROCEDIMENTO
Em um tubo de ensaio, colocar 2 ml da solução de proteínas. Adicionar,
deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 ml da solução de sulfato de
amônio. Foi observado e misturado o conteúdo do tubo (por inversão) e
anotamos os resultados. Repita as etapas anteriores usando NaCl ao invés de
(NH4)2SO4.

PRÁTICA 02 - Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito

da força iônica)
2.1 MATERIAIS
 solução de albumina 1g/mL;
 solução de (CH3COO)2Pb.3H2O (acetato de chumbo) a 20%;
 solução de ácido tricloroacético (CCl3COOH) 10% água destilada;
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 01 tubo de ensaio;
 pipetas (vidro ou plástica);

2.2 PROCEDIMENTO

- Precipitação por sais de metais pesados.

Em um tubo de ensaio, colocar 1ml da solução de proteínas. Adicionar 0,5 ml

da solução de acetato de chumbo. Adicionar 5 ml de água destilada. Observe e
interprete os resultados.

- Precipitação por ácidos.

Repita o procedimento anterior, substituindo a solução de acetato de chumbo

pela solução de ácido tricloroacético a 10%.

PRÁTICA 03 - Precipitação por ação do calor (desnaturação)

3.1 MATERIAIS

 solução de albumina 1g/mL;

 01 tubo de ensaio;
 pipetas (vidro ou plástica);

3.2 PROCEDIMENTOS

Colocar 5 ml da solução de proteínas em um tubo de ensaio. Após isso, deixar

o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos (o tubo também pode ser
aquecido direto na chama de um bico de Bunsen). Retire o tubo do banho,
observe e anote os resultados.

PRÁTICA 04 - Precipitação das proteínas por solventes orgânicos

4.1 MATERIAIS
 sol solução de proteínas;
 etanol (CH3CH2OH) 95% gelado;
 acetona (CH3COCH3) gelada;
 cloreto de sódio (NaCl) sólido;
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 água destiladaução de albumina 1g/mL;

 04 tubos de ensaio;
 pipetas (vidro ou plástica);

4.2 PROCEDIMENTOS
Tome dois tubos de ensaio e coloque, em cada um, 2 ml da solução de
proteínas. Adicionar 4 ml de etanol gelado a cada tubo. Agite. Em um dos
tubos, coloque uma pequena quantidade de NaCl sólido, sob agitação.
Observe e responda: qual o efeito do álcool sobre a proteína na presença e na
ausência do eletrólito?
Adicione 6 ml de água destilada e observe. Repita as etapas anteriores
substituindo o etanol pela acetona; 8. compare os resultados.
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CONCLUSÃO

PRÁTICA 1

 Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento

da força iônica (aumento da concentração de íons) do sistema. Assim, quando
adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas,
as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as
moléculas proteicas, diminuindo a interação entre elas. Consequentemente,
temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. A esse
fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Em condições de elevada força iônica,
decorrente da adição de grandes quantidades de sal, temos o efeito contrário.
A água, que apresenta um grande poder de solvatação, passa a interagir com
as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da dissociação do sal.
Porém, a água apresenta maior tendência de solvatação de partículas menores
(nesse caso, os íons). As moléculas de água, ocupadas em sua interação com
os íons, deixam a estrutura protéica. Como consequência, temos maior
interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e,
consequentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno de
insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da
força iônica do meio dá-se o nome de "salting-out".

PRÁTICA 2

Os cátions de metais pesados como Hg 2+, Pb2+, Cu 2+, dentre outros,

formam precipitados insolúveis de proteínas. Essa precipitação é mais intensa
quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a
carga líquida da proteína é negativa, favorecendo a interação com os cátions
provenientes do sal.
      A precipitação abaixo do ponto isoelétrico através da adição de ácidos
fortes. Comparando com o mecanismo anterior: quando a proteína está abaixo
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do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação
da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o
fosfotunguístico e pírico.
      Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de
alterações do pH.

PRÁTICA 3

As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação

nativa) bem definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades
físico-químicas e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do
calor, que causa desorganização das cadeias polipeptídicas, com consequente
alteração conformacional. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e
altera as estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar
sua estrutura primária.
      A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da
proteína, levando à sua precipitação.

PRÁTICA 4
    
A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em
água. Isso acontece porque a água apresenta constante dielétrica bastante
elevada. Essa grandeza mede a capacidade de interação do solvente com o
soluto, o que difere para cada solvente. Para os solventes orgânicos, a
constante dielétrica é bem inferior à da água e, assim, a interação proteína-
proteína se sobressai e, consequentemente, a proteína precipita.
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ANEXOS
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REFERÊNCIAS

 SOUZA, K. A. F. D.; NEVES, V. A. Propriedades gerais das proteínas.

Disponível em:
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/
precipitacao_proteinas.ht m. Acesso em 28 de fevereiro de 2023.
 MARZZOCO, A. & TORRES, B. B. Bioquímica Básica. 3.ed. Rio de

Janeiro: Guanabara Koogan, 2007.

 CAMPBELL, M. K. Bioquímica. 3.ed. Porto Alegre: Artmed Editora, 2000.

T. MOTTA, VALTER. Bioquímica. 2ª Edição. Rio de Janeiro: MedBook, 2011.