Ministério da Educação

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

Campus Toledo
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia

Isabela Zanfrilli Pleul

Nathalia Claro Teodoro
Rebecca D'avila

Relatório de Bioquimica I
Propriedades e Reações de Precipitação das Proteínas

Toledo - PR
2022
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1 INTRODUÇÃO

Os aminoácidos são moléculas fundamentais que podem se comportar como

intermediadores e unidades formadoras de peptídeos e proteínas (THE BIOLOGY
PROJECT, 2003). Quando estas moléculas formam ligações peptídicas entre si,
compõem peptídeos e proteínas. Mesmo tendo mais de 300 aminoácidos na
natureza, as proteínas se sintetizam de maneira, quase exclusiva, a partir de um
grupo de 20 L-α-aminoácidos codificados pelo DNA. Estas proteínas podem ser
longas cadeias de peptídeos, de 100 a milhares unidades formadoras de
aminoácidos (NELSON; COX, 2014, RODWELL et al, 2015).
As proteínas ostentam quase uma infinidade de funções intracelulares,
regulando diversos processos através da sua reação e estando presente em todas
as células. Para uma análise segura e completa de uma proteína determinada, se
faz necessário sua separação de outras milhares de proteínas e componentes que
podem estar ligadas a ela. Nelson e Cox (2014) apontam que “a primeira etapa de
qualquer procedimento de purificação de proteína é romper as células, liberando
suas proteínas em uma solução chamada de extrato bruto”, considerando que a
maior parte destas macromoléculas é de origem microbiana ou tecidual. Tendo o
extrato bruto protéico, o isolamento da proteína de interesse pode-se fazer pela sua
precipitação.
A precipitação seletiva explora as diferenças da solubilidade relativa de
proteínas individuais. Este processo pode ocorrer em função de várias condições,
como variação do pH (precipitação isoelétrica), polaridade (precipitação com etanol
ou acetona) ou concentração de sal (separação de substâncias dissolvidas pela
adição de sulfato de amônio à solução) (RODWELL et al, 2016). Outros fatores
também podem precipitar uma proteína, como a temperatura e adição de solventes
(como ninidrina e biureto). Os métodos cromatográficos estão entre os mais
eficientes para o processo (NELSON; COX, 2014). A precipitação ocorre de maneira
que as reações intramoleculares são interrompidas e as proteínas desnaturam,
agregam e formam colóides na solução (STONE, 2017).
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2 OBJETIVOS
Analisar as reações da proteína albumina, presente na clara do ovo e sua
precipitação a partir dos métodos: reação de precipitação com desnaturação, reação
de desnaturação sem desnaturação, reação com ninidrina e reação com biureto.
Quantificar as proteínas pelo método do biureto e absorbância da amostra.

3 METODOLOGIA

3.1 MATERIAIS E REAGENTES

3.1.1 Método de reação de precipitação de proteína com desnaturação

● Tubos de ensaio;
● Micropipeta automática de 1 mL;
● Pipeta de Pasteur;
● Vórtex;
● Banho-maria;
● Capela;
● Solução salina de cloreto de sódio 0,9%;
● Ácido tricloroacético 10%;
● Álcool etílico absoluto;
● Clara de ovo (Albumina);

3.1.2 Método de reação de precipitação de proteína sem desnaturação com salting

in e salting out

● Tubos de ensaio;
● Micropipeta automática de 1 mL;
● Pipeta de Pasteur;
● Béquer de 50 mL;
● Bastão de vidro;
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● Solução de cloreto de sódio 1 N;

● Solução saturada de sulfato de amônio;
● Clara de ovo (Albumina).

3.1.3 Método de reação de precipitação com ninidrina

● Tubos de ensaio;
● Micropipeta automática de 1 mL;
● Pipeta de Pasteur;
● Vórtex;
● Banho-maria;
● Solução de proteína de clara de ovo diluída com solução salina de cloreto de
sódio 0,9%;
● Glicina 0,05 M;
● Solução de ninidrina 0,1%;
● Água destilada.

3.1.4 Método de reação de precipitação com biureto

● Tubos de ensaio;
● Micropipeta automática de 1 mL;
● Pipeta de Pasteur;
● Vórtex;
● Solução de proteína de clara de ovo diluída com solução salina de cloreto de
sódio 0,9%;
● Glicina 0,05 M;
● Reagente de biureto;
● Água destilada.
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3.1.5 Método de quantificação de proteínas pelo método de reação com biureto

através da absorbância da amostra

● Tubos de ensaio;
● Micropipeta automática de 1 mL;
● Pipeta de Pasteur;
● Vórtex;
● Espectrofotômetro;
● Amostra de proteína desconhecida;
● Reagente de biureto;
● Água destilada.

3.2 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Previamente preparou-se em um tubo de ensaio uma solução de proteína da

clara de ovo diluída, adicionando 1 mL de amostra e 9 mL de solução salina de
cloreto de sódio 0,9%, com o auxílio de uma pipeta de pasteur e de uma micropipeta
automática, respectivamente. Agitou-se o tubo com um vórtex. Esta solução de
proteína diluída foi utilizada na realização dos métodos seguintes.

3.2.1 Método de reação de precipitação de proteína com desnaturação

Numerou-se os tubos de ensaio de 1 a 3. No tubo 1 adicionou-se com uma

pipeta de pasteur 2 mL de clara de ovo in natura e aqueceu-o em banho-maria a
100ºC, por tempo que bastasse para a desnaturação da proteína. No tubo 2,
utilizando uma micropipeta automática, foi transferido 1 mL da solução de proteína
diluída e 1 mL de ácido tricloroacético 10%. No tubo 3 pipetou-se 1 mL da solução
de proteína diluída e 3 mL de álcool etílico absoluto. Por fim, todos os tubos foram
agitados em vórtex para a homogeneização.
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3.2.2 Método de reação de precipitação de proteína sem desnaturação com salting

in e salting out

Em um béquer de 50 mL pipetou-se 3 mL de clara de ovo in natura.

Acrescentou-se água destilada em quantia que bastasse para a dissolução da
amostra. Mexeu-se a solução com bastão de vidro até o aparecimento de
precipitados de globulina da proteína, de cor esbranquiçada. Após o aparecimento
do precipitado, adicionou-se gota a gota - com uma pipeta de pasteur - solução de
cloreto de sódio 1 N à solução diluída até a redissolução dos precipitados de
globulina da proteína.

Em um novo tubo de ensaio, adicionou-se com uma micropipeta automática 2

mL de solução de proteína com salting in e mais 2 mL de solução de sulfato de
amônio saturada.

3.2.3 Método de reação de precipitação com ninidrina

Numerou-se tubos de ensaio de 1 a 3. No tubo 1 pipetou-se com uma

micropipeta automática 1 mL de água destilada. No tubo 2 pipetou-se 1 mL de
glicina 0,05 M. No tubo 3 pipetou-se 1 mL de solução de proteína diluída. Aos tubos
1, 2 e 3 adicionou-se, utilizando uma micropipeta automática, 2 mL de solução de
ninidrina 0,1%. Agitou-se os tubos em um vórtex. Levou-se os tubos de ensaio ao
aquecimento em banho-maria a 100ºC por cerca de 5 minutos.

3.2.4 Método de reação de precipitação com biureto

Numerou-se tubos de ensaio de 1 a 3. No tubo 1 pipetou-se com uma

micropipeta automática 1 mL de água destilada. No tubo 2 pipetou-se 1 mL de
glicina 0,05 M. No tubo 3 pipetou-se 1 mL de solução de proteína diluída. Aos tubos
1, 2 e 3 adicionou-se, utilizando uma micropipeta automática, 1 mL de reagente de
biureto. Por fim, agitou-se os tubos com um vórtex.
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3.2.5 Método de quantificação de proteínas pelo método de reação com biureto

através da absorbância da amostra

Em um tubo de ensaio, adicionou-se 1 mL de amostra de proteína

desconhecida e 5 mL de reagente biureto, utilizando uma micropipeta automática.
Agitou-se o tubo com um vórtex. Transferiu-se a solução para um cubeta e mediu-se
a absorbância da amostra em um espectrofotômetro.

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 Método de reação de precipitação de proteína com desnaturação

Feito o processo dos três tubos, agitando-os, concluiu-se os respectivos

resultados:

● Tubo 1 (proteína in natura): Desnaturação da proteína, “desenrolando” as

cadeias polipeptídicas. Apresentou espuma e uma cor amarelada.
● Tubo 2 (adição de 1 mL ácido tricloroacético 10%): Ocorreu uma pequena
precipitação da clara do ovo, trazendo uma cor amarelada/branca.
● Tudo 3 (adição de 3 mL de álcool etílico): A proteína se precipitou com mais
intensidade, devido ao rompimento de interações intramoleculares
estabilizantes de sua estrutura.

A Figura 1 e a Figura 2 mostram os resultados da diluição e dos precipitados

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Figura 1 - Solução de proteína diluída Figura 2 - Tubo 1, 2 e 3 precipitados da proteína

Conclui-se que para a desnaturação de proteínas, é preciso considerar

fatores, como: variação de temperatura, pH e ação de solventes orgânicos. A
desnaturação é capaz de desfazer interações intermoleculares (que ocorrem entre
partes de uma mesma proteína ou entre várias cadeias de proteína), deixando-a
apenas em sua estrutura primária.

4.2 Método de reação de precipitação de proteína sem desnaturação com salting in

e salting out

Através deste método, é possível visualizar o processo de precipitação de

globulinas e a redissolução, fazendo com que a força iônica original da Albumina
seja restaurada (salting in) - Figura 3. Ao transferir para um tubo de ensaio e
adicionar 2 mL de sulfato de amônio, percebe-se a transformação para um sistema
bifásico (salting out) - Figura 4.
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Figura 3 - salting in Figura 4 - salting out

4.3 Método de reação de precipitação com ninidrina

Ao comparar os resultados dos tubos 2 e 3 ao tubo 1, é possível visualizar

que as três amostras apresentam reação (Figura 5.), porém a glicina (tubo 2) reage
mais rapidamente, formando a cor violeta. Isso ocorre pois a glicina não possui
cadeia lateral, o que reduz o impedimento estérico. Na solução de Albumina diluída
(tubo 3) a cor foi semelhante à do tubo 1 (água destilada), azul claro, que pode
corresponder a baixa concentração de proteína da amostra em questão.

Resultando em:

● Tubo 1 (adição de 1 mL de água destilada): Coloração azul.

● Tubo 2 (adição de glicina 0,05 M): Coloração violeta claro.
● Tubo 3 (adição de 1 mL da proteína diluída): Coloração azul.

Figura 5 - reação com ninidrina

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4.4 Método de reação de precipitação com biureto:

O método de biureto tem finalidade de determinar a concentração de

proteínas em diversos meios, por ser um método que reage diretamente com a
ligação peptídica, os tubos 2 (glicina) e 3 (solução diluída), apresentaram a
coloração mais intensa, indicando mais concentração de cadeia proteicas.
Representado na Figura 6.

● Tubo 1 (adição de 1 mL de água destilada): Coloração transparente.

● Tubo 2 (adição de glicina 0,05 M): Coloração azul escuro.
● Tubo 3 (adição de 1 mL da proteína diluída): Coloração roxo escuro.

Figura 6 - Reação com biureto

4.5 Método de quantificação de proteínas pelo método de reação com biureto

através da absorbância da amostra

Após a mistura da “amostra desconhecida” com 5 mL de biureto, percebeu-se

uma cor escura (Figura 7.), ao transferir para o espectrofotômetro, notou-se um
resultado 0,255 nm sendo muito alto, fugindo do intervalo da curva padrão. Para
atingir um resultado menor, foi diluído a “amostra desconhecida” em água destilada
4x e, tornando a adicionar 5 mL de biureto. Concluindo uma amostra final de 0,097
nm, próximo aos intervalos 0,007 - 0,104 (Ponto 2 e 3 da concentração).
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O Gráfico 1 abaixo representa a curva padrão de absorbância, nele é

possível observar a absorbância de cada concentração e a regressão linear. Dado o
gráfico calculou-se o valor de x (nossa concentração na absorbância 0,097) que
resultou em 2,687.

Gráfico 1 - Curva de absorbância em função da concentração

0, 097 = 0, 035. 𝑥 − 0, 0008

𝑥 = 2, 687
Equação 1 - Cálculo da concentração em absorbância 0,097
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5 CONCLUSÃO

Conclui-se os processos de desnaturação, processo este que transforma a

ligação peptídica da proteína em uma estrutura primária, infere na precipitação da
proteína de interesse. Também é possível determinar precipitação, reverter esta
atividade, fazendo com que a interação intramolecular volte ao seu estado original.
A absorbância determinada está linearmente dentro dos resultados esperados, ou
seja, da curva-padrão.
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6 REFERÊNCIAS

NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6. ed. Porto

Alegre: Artmed Editora, 2014.

RODWELL, V. W. et al. Bioquímica Ilustrada de Harper. 30. ed. Mexico: Mc Graw

Hill, 2016.

STONE, J. Mass Spectrometry For The Clinical Laboratory. 1. ed. Londres:

Academic Press, 2016.

The Biology Project. Department of Biochemistry and Molecular Biophysics. The

Chemistry of Amino Acids. University of Arizona, 2003. Disponível em
<http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/aa/aa.html> Acesso em
2022.