11 outubro 2023

Relatório Trabalho
Experimental 2 -
Reações Coradas de
Proteínas
Licenciatura em Engenharia Biomédica
Prof.ª Maria Galante Maia

Alexandra Moura, 1220656

Ana Rita Silva, 1221193
Catarina Teixeira, 1220721
Mariana Silva, 1221248

Turma 2A
 Índice
Sumário..................................................3
Palavras Chave........................................3
Introdução...............................................3
Parte Experimental..................................4
Material e equipamentos utilizados..........4
Reagentes
utilizados................................................7
Procedimento...........................................8
Resultados e Discussão...........................11
Conclusão..............................................15
Bibliografia...........................................17
 Sumário
O segundo trabalho laboratorial realizado nas aulas práticas
desta unidade curricular consistiu na realização de três reações
diferentes: reação xantoproteica, reação de biureto e reação de
Folin-Lowry; com o objetivo de perceber qual das mesmas seria
a mais indicada para obtermos um pH da solução proteica mais
preciso.

Palavras chave
Proteína, reação xantoproteica, reação de biureto, reação de
Folin-Lowry, pH, reagentes

Introdução
A reação xantoproteica é característica de aminoácidos com um
anel aromático reativo, como a tirosina e o triptofano. A
introdução de grupos nitrato no anel aromático por meio do
ácido nítrico resulta na formação de substâncias com coloração.
O metodo do biureto é utilizado na quantificação de proteínas
totais. Neste procedimento, os ioes de cobre em ambiente
alcalino interagem com as ligações peptídicas, gerando uma
coloração púrpura. Essa coloração atinge a sua máxima
absorbância a 545 nm e, sob determinadas condições, é
diretamente proporcional à concentração de proteínas na
amostra. A maioria das proteínas mantém a sua atividade
biológica apenas numa faixa específica de valores de pH, e a sua
solubilidade varia dentro dessa faixa. Quando as proteínas são
expostas a extremos de pH, ocorre a desnaturação das mesmas,
sendo que o efeito mais notório é a perda de solubilidade na
maioria delas.
Em meios alcalinos, os íoes Cu2+ formam complexos com as
ligações peptídicas, resultando na redução desses íoes para Cu+.
O Cu+ e os grupos funcionais dos aminoácidos tirosina,
triptofano e cisteína reagem com o reagente Folin-Ciocalteau,
gerando a formação de um composto colorido (azul).
 Parte
Experimental
Material e equipamentos utilizados

Placa de
Gobelé
aquecimento

Tubos de ensaio Pipeta de

(e suporte) Pasteur
 Parte
Experimental
Material e equipamentos utilizados

Agitador de
Garfo
partículas

Pinça de
Hotte
madeira
 Parte
Experimental
Material e equipamentos utilizados

Vareta de Fita de medição

vidro do pH

Vidro Relógio Panela

 Parte
Experimental
Reagentes

Ácido Nítrico Concentrado (60%)

Solução de NaOH a 10%
Reagente de biureto (250 mL): 2,25 g de tartarato
de sódio e potássio; 0,75g CuSO4.5H2O, 1,25g KI;
dissolver em NaOH 0,1M
H2SO4 concentrado
NaOH 1M
Reagente A: 20g Na2CO3; 4,0g NaOH dissolver 1 L
água.
Reagente B: 0,5g CuSO4.5H2O; 1g de citrato de
sódio dissolver em 100 mL
Reagente C: Tartarato de sódio 2,9%
Solução de Lowry: Solução A + Solução B + Solução
C (100:1:1)
Reagente Folin-Ciocalteau: Reagente de Folin-
Ciocalteau 2N diluído em 1:1 água.
 Parte
Experimental
Procedimento
Começamos por bater muito bem uma clara de ovo de modo a
quebrar as membranas. De seguida, retiramos um pouco para um
tubo de ensaio e diluímos com cerca de 4 volumes de água.

I. Reação Xantoproteica
Retiramos 2 mL da solução de proteína para 1 tubo de ensaio e
adicionamos 0,5 mL de HNO3 concentrado (na hotte).
Repetimos o procedimento substituindo a solução de proteína
por 2 mL de água.
Aquecemos num banho de areia durante 2 min e observamos a
cor. Arrefecemos o tubo com água na torneira e alcalinizamos a
solução com 1mL de uma solução de NaOH a 10%.
Registamos a cor observada.
 Parte
Experimental
Procedimento

II. Reação de biureto

Adicionamos 2 mL de solução de proteína a um tubo de
ensaio. Num outro tubo juntamos 2 mL de água. Este tubo
funciona como controlo ou ensaio a branco que servirá de
termo de comparação.
Juntamos 10 gotas de solução de biureto a cada tubo de
ensaio.
Aquecemos por alguns segundos, a banho-maria, os tubos de
ensaio.
Agitamos e observamos a cor.
 Parte
Experimental
Procedimento Experimental

III. Efeito do pH na solubilidade

Retiramos 2 mL de solução de proteína para um tubo de
ensaio
Adicionamos 4 a 5 gotas de ácido sulfúrico concentrado.
Observamos e registamos.

IV. Reação de Folin-Lowry

Retiramos 2 mL da solução de proteína para 1 tubo de
ensaio e adicionámos 1 mL de NaOH 1N.
Preparamos um “branco” substituindo a solução de proteína
pr água.
Levamos à fervura durante 5 min e adicionamos 5 mL de
reagente de Lowry.
Aguardamos 10 min e adicionamos 0,2 mL de reagente Folin
Ciocalteau.
 Resultados e
Discussão
No estudo de todas as reações deste trabalho laboratorial, foi
utilizado um “branco” para servir de controlo ou termo de
comparação (substitui-se os 2 mL de solução de proteína por 2
mL de água).

1. Reação Xantoproteica
A reação xantoproteica tem como objetivo determinar a
presença ou ausência de aminoácidos específicos (com anel
aromático reativo, por exemplo a tirosina ou triptofano),
através do contacto da solução proteica com o ácido nítrico.
A adição de ácido nítrico concentrado causa a quebra das
interações entre os átomos na proteína, levando a uma
alteração na sua estrutura tridimensional. Isso resulta na
diminuição da solubilidade da proteína e, finalmente, na
desnaturação da mesma. O precipitado formado durante esse
processo gera nitroproteínas, que assumem uma tonalidade
laranja quando alcalinizadas com NaOH. Portanto, ao
adicionar mais NaOH 10% à solução, espera-se que a coloração
se torne ainda mais vibrante, variando de amarelo a laranja.
Isso ocorre devido à formação de compostos de nitrofenol, que
são responsáveis pela coloração observada.
Após a adição de 0,5 mL de ácido nítrico concentrado (HNO3)
aos dois tubos de ensaio com as soluções iniciais, observaram-
se algumas diferenças em relação às substâncias iniciais. (a
adição do ácido nítrico foi realizada na hotte).
 Resultados e
Discussão
1. Reação Xantoproteica (continuação)
No entanto, após o aquecimento de ambas as substâncias num
banho de areia durante 2 minutos, foi quando se observou a
maior diferença entre a solução inicial (solução de proteína
ficou com uma cor amarelada; solução “branco” não alterou a
cor).
Por fim, após a alcalinização das soluções com hidróxido de
sódio (NaOH), a solução de proteína voltou a alterar de cor,
passando de uma cor amarelada para um alaranjado, ficando
cada vez mais laranja com o aumento da alcalinização. A
solução de controlo/ “branco” permaneceu-se inalterável.

2. Reação de biureto
A reação de biureto deve-se às ligações peptídicas sendo
positiva para peptídeos e proteínas, com mais de dois
aminoácidos (proteínas totais). A coloração lilás será mais
intensa dependendo do número de ligações peptídicas.
 Resultados e
Discussão
2. Reação de biureto (continuação)
Foi possível verificar as diferenças nas soluções de proteína
e de controlo após a adição de 10 gotas de solução de
biureto.
Após o aquecimento de ambas as soluções, utilizado apenas
para acelerar as reações, observou-se uma alteração de cor
na solução proteica para uma cor púrpura.

3. Efeito do pH na solubilidade
O método em questão, permite estudar o comportamento das
proteínas em contacto com ácido sulfúrico.
Após a adição do ácido sulfúrico (hotte), verificou-se a
formação de um precipitado esbranquiçado.
 Resultados e
Discussão
4. Reação de Folin-Lowry
Como verificámos nas outras reações já mencionadas, a solução
“branco” voltou a não sofrer qualquer alteração e a solução
proteica voltou a alterar a sua cor, desta vez para uma cor
azul escuro, após a adição do reagente de Lowry.
Constatamos que este método é o mais sensível, uma vez que,
com uma mesma concentração da solução proteica, a
modificação obtida foi mais evidente do que os métodos
anteriormente descritos.
Através deste método é possível quantificar as proteínas. a
partir da medição espectrofotometrica em 750nm da cor azul
obtida, já que esta é proporcional ao teor de proteínas. Apesar
dessa medição não ter sido realizada, a solução aparenta
apresentar uma alta percentagem de proteínas devido à
intensa cor azul que se observou após a adição do reagente.
 Conclusão
O trabalho experimental apresentado, “Reações de Proteínas”,
apresentava como principal objetivo aprofundar métodos de
identificação de proteínas bem como o respetivo pH. Através da
aplicação e análise de reações, foi possível identificar a presença
de proteínas numa solução de clara de ovo e o seu pH. A solução
de controlo utilizada para cada reação consistia numa solução de
água desionizada.
A reação xantoproteica identifica a presença de aminoácidos
de cadeia lateral aromática pelo que se observou a formação de
um precipitado amarelo-claro. A precipitação ocorreu devido à
desnaturação causada pela quebra das interações entre os
átomos na estrutura das proteínas, o que diminuiu a sua
solubilidade, seguida do desenvolvimento da coloração amarela.
A reação consiste na nitração do anel aromático, formando
assim o nitrocomposto amarelo, o qual após a adição de base
NaOH, se transforma em sais de coloração alaranjada,
comprovando assim a presença de aminoácidos.
A reação de biureto resulta na formação de um complexo entre
o ião cobre II, Cu²+, e as proteínas ou peptídeos com mais de
dois aminoácidos. Nesta reação, o sulfato de cobre diluído em
meio alcalino (reagente de biureto) apresenta coloração azul-
claro e, ao reagir com as ligações peptídicas, forma produto de
coloração violeta, o que caracteriza a formação do complexo de
coordenação entre o cobre e os átomos de nitrogénio das ligações
peptídicas adjacentes. Assim, conclui-se que a solução proteica
dá resultado positivo ao apresentar coloração violeta devido à
formação do complexo com o cobre, ao contrário da água, que
serve de branco, pois mostra apenas a coloração do reativo de
biureto que é azul-claro.
 Conclusão
(continuação)

De modo a analisar o efeito do pH na solubilidade, foram

adicionadas gotas de ácido sulfúrico à solução de proteína. Isto
permitiu observar que a textura da solução proteica foi alterada
com a adição do ácido.
Por último, o método de Folin-Lowry envolve duas reações
químicas. A primeira reação consiste na redução do ião cobre II,
Cu²+, formando um complexo com as ligações peptídicas, em
condições alcalinas. A segunda reação envolve a redução do
reagente Folin-Ciocalteau pelo complexo cobre-ligação
peptídica, causando uma mudança na coloração da solução para
azul-escuro, ao contrário do que ocorreu na solução controlo que
permaneceu incolor. A cor azul resultante da reação depende
em parte do teor de tirosina e triptofano.
Em suma, uma vez que os diferentes métodos aplicados
demonstraram resultados positivos para a presença de proteínas
na solução de clara de ovo, é possível concluir que o objetivo
deste trabalho experimental foi alcançado com sucesso.
 Bibliografia

Microsoft Word - Manual Laboratório 23_24b (ipp.pt)

12221710072012Quimica_Biomoleculas_aula_5.pdf (ufs.br)
O método Lowry para quantificar proteínas | Cultura de
células (cellculture.altervista.org)
Domingues, V. ; Maia, M. L. ; Rocha, J. M. (2023) “Introdução
aos trabalhos laboratoriais” disponível via moodle
Domingues, V. (2023) “Manual de laboratório” disponível via
moodle