UNIVERISADE

FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE
CIÊNCIAS
BIOLÓGICAS
CÂMPUS
SAMAMBAIA
DISCIPLINA DE
BIOQUÍMICA

RELATÓRIO SOBRE A DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE PROTEÍNAS PELA

REAÇÃO DE BIURETO
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Goiânia
2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

RELATÓRIO SOBRE A SOBRE A DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA PELA REAÇÃO

DE BIURETO

Relatório da segunda aula prática da

disciplina de Bioquímica ministrada pela Prof.
Dra. Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite,
realizada no laboratório 9 do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade Federal
de Goiás.
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Goiânia, GO
2019

Sumário

1 Introdução...................................................................................................4
2 Materiais.....................................................................................................5
3 Métodos......................................................................................................6
4 Resultados..................................................................................................7
4.1 Reagente de Biureto e sua relação com proteinas....................................7
4.2 Procedimentos...........................................................................................8
4.3 Valores de Absorbância.............................................................................8

4.4 Reativos e Absorbância..............................................................................9

4.5 Curva padrão da dosagem de caseína.....................................................10

5 Conclusão....................................................................................................11

6 Referências Bibliográficas...........................................................................11
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1. Introdução

As proteínas são consideradas umas das substâncias mais importantes para

o organismo, pois são as macromoléculas mais abundantes nas células e realizam
diversas funções, como a manutenção dos órgãos e também agem na parte
estrutural do organismo.
Elas são polímeros naturais formadas por aminoácidos que em sua estrutura
apresentam um grupo amino, uma cadeia lateral R e um grupo carboxílico. Para que
sejam feitas as proteínas ocorrem ligações químicas entre os aminoácidos (apenas
20 são usados na formação de proteínas) no grupo carboxílico de um e no grupo
amino do outro, formando uma amida, e eles estarão formando cadeias e serão
conectados entre si através de ligações peptídicas.
Em diversos experimentos, as proteínas reagem com alguns reagentes
devido as ligações peptídicas. Um teste muito usado é a determinação colorimétrica
pela reação de biureto, que tem o intuito de detectar se há ligações peptídicas na
solução. Sendo assim, os compostos quando são submetidos numa solução diluída
de sulfato de cobre em meio alcalino apresentam uma coloração violeta, indicando
que possuem as ligações da proteína.
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2. Materiais

 5 Tubos de Ensaio pequenos

 Caseína 1%
 Glicina 1%
 NaOH 1,0 mol/L
 Reativo de Biureto (sulfato de cobre 0,5%)
 Espectofotômetro
 Agitador de tubos (vórtex)
 Água destilada
 Pipetas Graduadas de 1 e de 10ml

Figura1.1: Na figura acima estão representados os materiais utilizados no experimento. Da esquerda

para a direita estão: NaOH 1,0 mol/L, Glicina 1%, Caseína 1% e o reativo de biureto.
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Figura 1.2: Água destilada

Figuras 1.3 e 1.4 estão conjugadas acima. Estão representando as pipetas graduadas, à esquerda está a pipeta
de 1ml e à direita está a pipeta de 10ml

Figura 1.5: Está representando o Agitador de tubos (vórtex)

3. Métodos

Inicialmente foram pegos cinco tubos de ensaio, o primeiro foi denominado

de tubo branco, o segundo de glicina e os restantes foram numerados de 1 a 3. Foi
adicionado 1mL de água destilada no tubo branco, no tubo glicina foi adicionado
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1mL de glicina. Já nos tubos 1,2 e 3 foram adicionados caseína, mas em volumes
diferentes.
No tubo 1 foi adicionado 0,2 mL de caseína, no tubo 2 adicionado 0,6 mL de
caseína e no tubo 3 adicionado 1mL de caseína.
Depois desse estágio, os tubos 1 e 2 foram completados com 1mL de água
destilada. Consequentemente foram adicionados 3mL de NaOH 1,0 mol/L em todos
os tubos e posteriormente foi adicionado 0,4 mL de Biureto em todos os tubos.
Esperou-se a reação se processar por 15 minutos.

Figura 1.6: a Imagem acima mostra a coloração obtida em cada tubo, depois de realizados os procedimentos
citados anteriormente.

4. Resultados

4.1 Reagente de biureto e sua relação com proteínas

Constituído de Sulfato de Cobre (CuSO4) e Hidróxido de Sódio (NaOH), o

biureto tem como uma de suas funções estabilizar o cobre em solução com o auxílio
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de um complexante, sendo que o tartarato de sódio é o mais utilizado. Em ambiente

alcalino, o cobre reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com
a ligação peptídica. Normalmente, o espectrofotômetro é calibrado na banda de
absorção de 270 nm ou em 530 nm. No experimento realizado, foi utilizada a banda
de 530 nm, uma vez que a utilização desta é a mais adequada para fins analíticos, já
que diversas substâncias absorvem na banda de 270 nm, ocasionando diversas
interferências no método.

4.2
Reativos B G 1 2 3
Água destilada 1,0 -- -- -- --
(mL)
Solução de -- 1,0 -- -- --
glicina (mL)
Solução de -- -- 0,2 0,6 1,0
caseína 1% (mL)
Água destilada -- -- 0,8 0,4 --
(mL)
NaOH 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
Biureto (mL) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4
Procedimentos

Inicialmente, identificou-se 5 tubos de ensaio: Branco (B), Glicina (G), 1, 2 e

3. Posteriormente, foi adicionado 1 mL de água destilada no tubo B, 1 mL de glicina
no tubo G. Além disso, foi inserido 0,2 mL, 0,6 mL e 1 mL de caseína nos tubos 1, 2
e 3, respectivamente. Nos tubos 1 e 2 foi adicionado água destilada até completar 1
mL.
Para alcalinizar o meio, foi colocado 3 ml de NaOH 1 mol/L em todos os
tubos. O reagente de biureto também foi adicionado em todos os tubos, no volume
de 0,4 ml. A tabela 1 contém uma melhor descrição da quantidade dos materiais:
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Tabela 1

4.3 Valores de absorbância

Após agitar os tubos, para homogeneizá-los, esperou-se 15 minutos para
que a reação fosse processada.
Antes dos tubos serem colocados no espectrofotômetro, o aparelho foi
calibrado/zerado no comprimento de onda de 530 nanômetro (nm) com o tubo B
(branco) que apresenta 0 de absorbância para aquele comprimento de onda.
Verificou-se a absorbância das soluções B, G, 1, 2 e 3 no espectrofotômetro,
sendo anotados os valores presentes na tabela 2:

Tubos Absorbância
B 0,000
G 0,020
1 0,097
2 0,735
3 0,035
Tabela 2

4.4 Reativos e a absorbância

O método do biureto é baseado na reação do sulfato de cobre em meio

alcalino com proteínas e peptídeos. No processo foi utilizado o NaOH 1mol/L para
alcalinizar o meio, a fim de que as ligações peptídicas das proteínas (-CONH-)
reajam com os íons cúpricos e formem um complexo de coloração violeta que é
proporcional ao teor das proteínas no meio, como é mostrado na figura 1.6. Um
esquema dessa reação é apresentado na figura 1:

Figura 1 Fonte: Bioquímica – LCB 208 Roteiro De Aulas Práticas

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Como é mostrado na figura 1, a glicina que foi adicionada no tubo G, não

pode se complexar com os íons cúpricos. Essa circunstância é explicada pelo fato
de a glicina ser um aminoácido livre e esses íons só reagem com proteínas e
peptídeos de pelo menos duas ligações peptídicas. Por esse motivo, a absorbância
do tubo G foi muito inferior às encontradas nos tubos 1, 2 e 3.
Portanto, quanto maior a concentração de caseína na amostra, mais intensa
é a coloração observada e maior a absorbância encontrada. No entanto,
possivelmente por um erro na pipetagem dos reativos, o valor de absorbância
encontrado para a solução do tubo 3 foi inferior ao esperado, de forma que a
proporcionalidade entre volume de caseína (proteína) e absorbância não foi
obedecida. Esse fato é mostrado na tabela 3:

Tabela 3

4.5 Curva padrão de dosagem da caseína

A partir dos dados da tabela 3, foi possível construir a curva padrão de

dosagem da caseína:

Tubos Solução de caseína 1% Absorbância

(ml)
B -- 0,000
G -- 0,020
1 0,2 0,097
2 0,6 0,735
3 1,0 0,035
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Gráfico 1 – curva padrão de dosagem de caseína

A curva padrão de dosagem de caseína deveria ser uma reta/linear, como é

mostrado na linha de tendência do gráfico (linha pontilhada), devido à
proporcionalidade que há entre o volume de proteínas (ml) e a absorbância.
Contudo, devido ao erro mencionado anteriormente, o gráfico 1 não segue no
esperado.

5. Conclusão

A análise dos dados mostra que o método do biureto permite a identificação

de proteínas e peptídeos com mais de duas ligações peptídicas, bem como a
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relação diretamente proporcional entre o volume destas e a absorbância de uma

amostra.
Também foi possível concluir que a glicina, por ser um aminoácido livre, não
se complexa com os íons cúpricos, já que estes só reagem com moléculas
(proteínas e peptídeos) a partir de duas ligações peptídicas. Portanto, a solução não
muda de cor e a absorbância encontrada é muito inferior às soluções com caseína
(proteína).
A ocorrência do erro durante a preparação da amostra não impossibilitou a
análise do procedimento realizado, uma vez que os tubos B, G, 1 e 2 permitiram a
constatação da proporcionalidade, através dos volumes de solução de caseína e
suas respectivas absorbâncias. Além disso, a averiguação das cores das amostras,
corroborou essa evidência, já que quanto maior o volume de proteínas, mais
arroxeada é a solução.

6. Referências Bibliográficas

LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica. 4.

ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.

http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914 - Determinação De Proteínas Totais Via

Espectrofotometria: Vantagens E Desvantagens Dos Métodos Existentes. Acesso
em: 15/11/2019

https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3935666/mod_resource/content/1/Apostila
%20Bioquimica%202014_LCB%20208.pdf - Bioquímica – LCB 208 Roteiro De
Aulas Práticas. Acesso em: 15/11/2019