UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

CAMPUS ALTO PARAOPEBA

RELATÓRIOS DE IMUNOLOGIA APLICADA A BIOPROCESSOS

Relatório apresentado como parte das

exigências da disciplina de Imunologia
Aplicada a Bioprocessos Experimental sob
responsabilidade do professor Antônio
Helvécio Tótola.

Mariana Maciel Bertolino Diniz – 154200050

OURO BRANCO – MG
JULHO/2021
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DOSAGEM DE PROTEÍNAS E ELETROFORESE

INTRODUÇÃO

As proteínas são extremamente importantes para o bom funcionamento do organismo,

sendo estas encontradas em uma variedade de formas, como anticorpos, enzimas entre outras
e tendo papeis fundamentais no combate a doenças, regulando funções do corpo entre outras
funções e, para saber se estas estão em equilíbrio podemos dosa-las através da técnica de
dosagem, onde purifica-se a proteína de interesse e a quantifica.

Após a realização da técnica de dosagem de proteínas, exe4cuta-se a eletroforese em

gel, onde ocorre a separação de moléculas carregadas e assim, estas são separadas de acordo
com suas propriedades físicas e peso molecular, à medida que passam por uma corrente
elétrica. A eletroforese em gel é uma técnica na qual moléculas carregadas, como as
proteínas, são separadas de acordo com suas propriedades físicas e peso molecular à medida
que passam por uma corrente elétrica.

OBJETIVO

Purificação de anticorpos IgY a partir da gema do ovo e identificação da concentração

através da eletroforese em gel.

MATERIAIS E MÉTODOS

Quebrou-se a casca de um ovo cuidadosamente retirando todo excesso de clara. A

gema foi transferida para o papel filtro para remover o restante da clara, rompeu-se a pele da
gema com um instrumento de ponta fina e o conteúdo foi transferido para um tubo falcon.

O volume inicial da amostra de gema foi medido e em seguida adicionou-se a solução

de precipitado A (PBS/PEG 4000 5,25%), a solução da gema na proporção 1:2. Colocou-se
a mistura sob agitação mecânica durante 5 minutos em temperatura ambiente. Adicionou-se
aos tubos PBS e centrifugou-se a solução a 4 ºC durante 10 minutos a 3500 rpm. O
sobrenadante foi filtrado e em seguida descartou-se o precipitado.

Mediu-se o volume do filtrado e adicionou-se a solução de precipitação B (PBS/PEG

4000 42,5%) e agitou-se por 5 minutos e centrifugou-se a 3500 rpm a 4 °C durante 10
minutos.

O sobrenadante foi descartado e o precipitado suspendido em 5 mL de PBS.

Adicionou-se a solução de precipitação C (PBS/PEG 4000 24%) na proporção 1:1. Colocou-
se sob agitação por 5 minutos e centrifugou-se a 3500 rpm a 4 °C durante 10 minutos.
Descartou-se o sobrenadante e suspendeu-se novamente o precipitado em 3mL de PBS. Em
levou-se para dialise, usando o Cassete G2 de capacidade de 3ml. No primeiro momento o
cassete foi colocado em um recipiente contendo NaCl 0,1 molar. Passado um pouco mais de
uma hora o NaCl foi substituído pelo PBS diluído uma vez, e o cassete então foi colocado
em 1800 ml de água com 200 ml de PBS.
 3

Preparou-se a solução do gel de resolução colocando-se em um béquer água mais

solução de acrilamida-bisacrilamida, Tris 1,5 M pH 8,8 (SDS 10%) e, por último, adicionou-
persulfato de amônio e TEMED. Verteu-se a solução delicadamente, com o auxílio de uma
pipeta, para que não houvesse formação de bolhas. Adicionou-se água destilada sobre a
superfície do gel e aguardou-se, aproximadamente, por cerca de 20 a 30 minutos até sua
completa polimerização, adicionou sobre o gel de resolução. Retirando-se a água colocada
sobre o gel de resolução. Em seguida introduziu-se um pente no gel para que fosse formado
um poço. Transferiu-se o gel para a cuba eletroforética e colocou-se o tampão de corrida
conforme as especificações do aparelho.

As amostras foram misturadas a um corante azul de Coomassie para dar coloração,

servir como indicador do progresso eletrofotoelétrico e aumentar sua densidade evitando que
saíssem dos poços em forma de dente no gel no qual foram colocados. Aplicou-se cada uma
das amostras, com cuidado, dentro de cada poço formado. Ligou-se a fonte para corrida sendo
que, quando o azul de Coomassie atingiu o fim do gel de resolução, desligou-se a fonte e
retirou-se a tampa da câmara despejou-se a solução de eletroforese e removeu-se o gel que a
seguir foi corado.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A proteína da gema do ovo, IgY é um tipo de anticorpo solúvel, que forma solução
com um diluente apropriado. O diluente utilizado foi o tampão PBS 1x, que é uma solução
salina tamponada, utilizada na purificação com o intuito de evitar variações bruscas de pH
durante o processo de purificação, para que a proteína não desnature. Esse tipo de purificação
por precipitação utilizada foi PBS/PEG 4000 em diferentes porcentagens de concentração
para que tenha uma diferença de densidade significativa entre a solução PBS/PEG e a
proteína de interesse. A solução PBS/PEG aumenta a solubilidade do anticorpo. O
componente PEG do sistema reduz a solubilidade da molécula alvo pela modificação da
solução e o PBS reduz a solubilidade por alterações da molécula alvo, ou seja, alterando-se
as propriedades do meio por mudanças na força iônica e no pH, por adição de solventes
orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, altera-se a solubilidade das proteínas.

Após adicionar a amostra inicial ao sistema e realizar a agitação, a solução

transformou-se em uma solução bifásica, e o sobrenadante continha a proteína de interesse,
anticorpo IgY. Na terceira agitação mecânica o sobrenadante passou a ser a solução de PEG
4000 e água e o precipitado continha a proteína de interesse, a utilização da água impede que
a proteína não sofra interação com a solução de PEG. Essa diferença da posição da proteína
de interesse na solução acontece devido a variação da concentração de PEG 4000 adicionado
a cada etapa e também ao volume de amostra da gema. A concentração de substâncias do
ovo vai diminuindo a cada agitação mecânica e com isso os anticorpos ficam cada vez mais
concentrados aumentando seu grau de pureza. A diálise foi realizada para remoção de PEG
e contaminantes e o sal adicionado, NaCl (1 mol.L-1), possibilitou a remoção do PBS. Com
isso a utilização de PBS/PEG 4000 em diferentes porcentagens de concentrações foi essencial
para aumentar o grau de purificação de IgY. Para encontrar a concentração das proteínas
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construiu –se a tabela 1 para que os gráficos fossem plotados, ao qual pode se ver na imagem
1.

Tabela 1 – Resultados para a construção da curva de calibração

Concentração (mg/mL) ABS Replicata 1 ABS Replicata 2 ABS Replicata 3

1,00 0,494 0,492 0,49
0,50 0,38 0,378 0,377
0,25 0,225 0,229 0,227
0,125 0,151 0,15 0,155
0,0625 0,07 0,072 0,075

Imagem 1 – Curvas de calibração

A partir das curvas, construiu-se as tabelas 4, 5 com as concentrações amostrais e

assim descobriu-se a concentração da proteína purificada, sendo esta multiplicada por 2 que
é seu fator de diluição.

Tabela 4 – Cálculo das concentrações das replicatas

Absorbâncias Concentração na Concentração na Concentração na

amostra 8 Replicata 1 Replicata 2 Replicata3
0,601 1,16 1,17 1,18
0,611 1,19 1,20 1,20
0,617 1,20 1,21 1,22
Média 1,18 1,19 1,20

Tabela 5 – Concentração real da proteína purificada

Concentrações reais Média Desvio Padrão Erro % Erro médio % Dispersão %

1 2,37 2,39 0,02 0,66 0,48 0,70
2 2,38 0,06
3 2,40 0,73
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Dessa forma sabe-se que a concentração da proteína purificada é de

2,39±(0,02)mg/mL, com um erro de 0,48% e dispersão de 0,70%, muito baixos, considerando
o método válido e preciso, após descobrir a concentração, para ter certeza da presença da
proteína realizou-se a eletroforese em gel, obtendo a imagem 2 para a amostra 8.

Imagem 2 – Gel de eletroforese

O resultado da eletroforese mostra o aparecimento de duas bandas. A cadeia leve

(25kDa) e a cadeia pesada (70 kDa). Essas cadeias são mantidas juntas por pontes dissulfeto
intercadeia e por interações não covalentes. O número de pontes dissulfeto varia entre as
diferentes moléculas de imunoglobulinas.

CONCLUSÃO

Conclui-se assim que a concentração da proteína purificada é de 2,39±(0,02)mg/mL

e o procedimento foi realizado com sucesso. O anticorpo foi purificado da gema do ovo pelo
sistema aquoso de duas fases que permite a separação do anticorpo das demais moléculas
presentes no ovo. O procedimento possibilitou uma maior concentração do anticorpo e um
maior de grau de pureza.
 6

REFERÊNCIAS

ABBAS, A. K; LICHTMAN, A. H. Imunologia Básica: funções e distúrbios do sistema

imunológico. 3.ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2009.

FIO CRUZ. O Que São Anticorpos Monoclonais. Disponível em:

http://www.bio.fiocruz.br/index.php/perguntas-frequentes/227-o-que-sao-anticorpos-
monoclonais. Acesso em: 26 Jul. de 2021.

KASVI. Western Blotting: Análise de Proteínas. Disponível em:

https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/. Acesso em: 26 Jul. 2021.

LEMOS, M. Exame de proteínas totais e frações: o que é e como entender o resultado.

Disponível em: https://www.tuasaude.com/exame-de-proteinas/. Acesso em 26 Jul. 2021.

MONTASSIER, H. J. PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES

NO SORO NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-
GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO. Disponível em:
https://www.fcav.unesp.br/Home/departamentos/patologia/HELIOJOSEMONTASSIER/au
la-pratica-3---purificacao-de-anticorpos-e-precipitacao-com-sulfato-de-amonio.pdf. Acesso
em: 26 Jul. 2021.

NEWS MEDICAL LIFE SCIENCES. Técnicas da purificação do anticorpo. Disponível

em: https://www.news-medical.net/life-sciences/Antibody-Purification-Techniques-
(Portuguese).aspx. Acesso em 26 Jul. 2021

SILVA JR, W. F.¹; CARVALHO, B. M. A.² MODELAGEM E SIMULAÇÃO DE

PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS POR CROMATOGRAFIA
DE TROCA IÔNICA. Disponível em:
http://revista.oswaldocruz.br/Content/pdf/Edicao_18_Willer_Ferreira.pdf. Acesso em 26
Jul. 2021.
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DOT BLOT

INTRODUÇÃO

Este método é uma variante da técnica de Southern Blot, onde aplica-se o DNA alvo
diretamente sobre a membrana e em seguida ocorre a hibridização, a diferença consiste na
separação eletroforética que não ocorre na técnica de Dot Blot. Este é um método em que se
determina de forma rápida as concentrações de ácidos nucleicos presentes em uma amostra.

Este é muito utilizado para a determinação da quantidade de produto obtido sem que
precise se analisar o peso molecular e número de espécies presentes na amostra.

OBJETIVOS

Detectar através do método de Dot Blot a presença da proteína X presente no ovo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Em um pedaço de membrana de nitrocelulose (Westran S, GBS 10413096, poro

0,2μm e tamanho 26cm x 3,1M) marcou-se a região de aplicação da amostra com um lápis,
em seguida ativou-se a membrana com metanol por 15 segundos e colocou-se sobre um
pedaço de papel alumínio. Com auxílio de uma pipeta aplicou-se no ponto marcado 2μL da
proteína. A membrana foi levada para secar em estufa a 37 ºC por 30 minutos.

Os sítios não específicos foram bloqueados por imersão da membrana em PBS-Tween

0,05% com pH 7,2 (pH ótimo para a ligação do anticorpo), albumina 10%. Incubou-se por
1 hora a temperatura de 37ºC . Em seguida lavou e coloco o anticorpo. Incubou por mais um
hora. Após lavou-se a membrana 4 vezes com PBS-Tween 0,05% (4x 5min). Incubou-se com
anticorpo primário IgY, anti-NS1, controle negativo e controle positivo em diluição de
1:1000 PBS- Tween 0,05% albumina 10% por uma hora e em seguida lavou-se a membrana
4 vezes com PBS-Tween 0,05% (4x 5min).Aplicou-se o anticorpo secundário, anti-IgY
conjugado com HPR na diluição de 1:5000 PBS-Tween 0,05% albumina 10%, por uma hora
então lavou-se a membrana 4 vezes com PBS-Tween 0,05% (4x 5min).

Preparou-se uma solução de DAB (Diaminobenzida) em tampão Tris e a membrana

foi recoberta com ela. Incubou-se até o aparecimento da coloração. A reação foi interrompida
com água destilada.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A técnica realizada detectou a proteína X presente na amostra, apresentando então um

resultado positivo para a presença da proteína visto que o branco se apresentava sem nada. A
figura abaixo mostra o resultado do Dot Blot. A presença de um halo colorido indica uma
alta concentração de anticorpo primário e que a reação foi completa, devido a uma maior
quantidade de título.
 8

Figura 1: Resultado Dot Blot, amostra 8, com o Branco de Controle Negativo

A membrana foi ativada com solução de metanol para que houvesse maior afinidade
entre elas, pois mesmo tendo alta sensibilidade, ela possui baixa especificidade de ligação.

Foi usado PBS-Tween com o objetivo de bloquear sítios não específicos da

membrana, ou seja, evitar que houvesse ligação de outro componente, que não a proteína X.
Com isso evita-se que ocorram resultados falso-positivos ou falso-negativos. Para que o pH
se mantivesse numa faixa de estabilidade, 7,4 – 7,6 (próximo ao do corpo humano), o tampão
de lavagem durante a reação foi o PBS-Tween 0,05%, facilitando a ligação antígeno-
anticorpo.

O anticorpo primário IgY anti-X, purificado foi incubado junto à membrana para que
houvesse a reação antígeno (X)-anticorpo (IgY). A aplicação do anticorpo secundário anti-
IgY é feita com o conjugado com HRP, que é responsável por proporcionar coloração quando
ocorre a interação do anticorpo com a proteína.

CONCLUSÃO

O Dot Blot é um método altamente sensível, capaz de selecionar características

fenotípicas das amostras e analisar a presença de alguma molécula específica na mesma. O
método demonstrou-se eficiente, para os objetivos do experimento, identificando a presença
da proteína X.
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REFERÊNCIAS

GONÇALVES, L. A. Seleção de colônias de Clostridium Perfringens tipo D produtoras

de toxina épsilon por “Dotblot”. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Escola
de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2004.

MIGUEL, M. P.; MENEZES, L. B.; ARAÚJO, E. G. Western Blotting: A técnica e

aplicações na pesquisa e rotina diagnóstica em medicina veterinária. Enciclopédia Biosfera,
Goiânia, nov. 2012.

PINHEIRO, R. R. et al. Desenvolvimento de dot-blot para detecção de anticorpos para

o vírus da Artrite Encefalite Caprina em caprinos. Disponível em:
https://www.embrapa.br/busca-de-publicacoes/-/publicacao/909420/desenvolvimento-de-
dot-blot-para-deteccao-de-anticorpos-para-o-virus-da-artrite-encefalite-caprina-em-
caprinos. Acesso em: 26 Jul. 2021

RAMOS, E. M. de S. Sistemas Multiplex para a detecção e caracterização Molecular

de Infecções. Disponível em: https://bdigital.ufp.pt/bitstream/10284/3575/3/T_13067.pdf.
Acesso em 26 Jul. 2021.

UFSM. ENSAIOS IMUNOLÓGICOS. Disponível em:

http://www.ebah.com.br/content/ABAAAATWEAH/ensaios-imunologiacos. Acesso em:
26 Jul 2021.
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WESTERN BLOT

INTRDUÇÃO

É uma técnica baseada na transferência de amostras de um gel para uma membrana e

assim poder realizar a detecção desta amostra. Conhecida a partir de 1979, essa se tornou
muito utilizada para a análise de proteínas e também para a obtenção de sua massa molecular
e a quantidade presente em uma amostra, se baseando em algumas etapas, tais como A
primeira etapa é a realização da extração e a quantificação das proteínas, e assim utiliza-se
da eletroforese em gel para separar as amostras homogêneas, ocorre a transferência para uma
membrana e assim revelam-se os dados.

OBJETIVO

Detectar a presença da proteína X utilizando a método de Western Blot.

MATERIAIS E MÉTODO

Os passos para elaboração dessa técnica baseiam se na separação das proteínas por
eletroforese. Extraiu-se e quantificou-se as proteínas presentes, aplicaram na no gel de
eletroforese e transferiu-se para uma membrana, incubou-se a membrana com o anticorpo
anti Igy para a detecção da proteína X e revelou-se a membrana.

Como a membrana tem uma alta afinidade por proteínas, a bloqueou com solução de
bloqueio, um tampão de TBS pH 7,5 + Tween 20 0,3% + Leite Desnatado 5% durante no
mínimo uma hora incubando-a em temperatura ambiente em constante agitação. Após o
bloqueio, lavou-se com a solução de lavagem de TBS + Tween 20 0,3%, por 3x a cada 5
minutos. Após lavada aplicou-se a proteína X ao antígeno presente na membrana. A diluição
do anticorpo foi realizada na solução de bloqueio.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Após a separação das proteínas por eletroforese, houve a aplicação da técnica de

Western Blot para imunodetecção de proteínas, observando a imagem 1, vimos que a proteína
X foi quantificada de forma correta, onde a separação do peso molecular ocorreu, sendo visto
pela sua faixa de 40 a 240Kda, assim como as outras técnicas realizadas essa é uma das mais
eficientes.

Imagem 1 – Resultado Western Blot para a proteína 1

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A molécula de anticorpo conjugado é o antígeno anti Igy que é ligado covalentemente

a enzima e tem como função conservar as funções de atividade enzimática especificidade da
imunoglobulina, ao estar revelado, mostras que este anticorpo reconheceu a presença do
anticorpo da proteína X, sendo assim como observado e o que ocorreu foi que nos locais onde
estava presente, ocorreu a reação e a formação do produto dessa reação, apareceu a marcação
nas regiões em que ocorreu essa reação, permitindo localizar a proteína de interesse.

CONCLUSÃO

Conclui-se assim que o método de Western Blot é eficiente e eficaz para medir o peso
molecular das proteínas, e realizar a separação de amostras complexas, visto que as amostras
variaram seu peso entre 40 a 250 Kda, mostrando assim a sensibilidade do método.
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REFERÊNCIAS

GVS. O que é Western Blotting? Entenda como funciona e a importância desta técnica.
Disponível em: https://www.gvs.com.br/blog/life-sciences/o-que-e-western-blotting-
conheca-esta-tecnica-utilizada-na-biologia-molecular/. Acesso em: 27 Jul. 2021.

KASVI. Western Blotting: Análise de Proteínas. Disponível em:

https://kasvi.com.br/western-blotting-analise-proteinas/. Acesso em: 27 Jul. 2021.

MIGUEL, M. P.; MENEZES, L. B. de; ARAÚJO, E. G. de. WESTERN BLOTTING: A

TÉCNICA E APLICAÇÕES NA PESQUISA E ROTINA DIAGNÓSTICA EM
MEDICINA VETERINÁRIA. Disponível em:
http://www.conhecer.org.br/enciclop/2012b/ciencias%20agrarias/western.pdf. Acesso em
27 Jul. 2021.

RODRIGUES, A. S.; et al. Padronização do Elisa indireto e Western Blot para

diagnóstico da artrite-encefalite caprina. Disponível em:
https://www.scielo.br/j/abmvz/a/j3TzRxGdq8ZZBtwqkSLwGZr/?lang=pt&format=pdf.
Acesso em: 27 Jul. 2021.

USP. Dosagem de proteínas pelo método de Bradford. Disponível em:

https://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=25955. Acesso em: 27 Jul. 2021.
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ELISA

INTRODUÇÃO

O teste de “ELISA” (do inglês “Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay) utiliza-se

das detecções de reações enzimáticas do antígeno-anticorpo, sendo a enzima mais
comumente utilizada nestas provas é a peroxidase. Existem vários tipos de ensaios que se
utilizam esta metodologia, sendo o método direto, indireto, “SANDWICH” e por competição.

O ELISA direto é feito através da imobilização do antígeno (impregnação) na placa,

onde pipeta-se um anticorpo ligado a uma enzima uma enzima. No ELISA indireto, o
antígeno é imobilizado diretamente na placa, e a detecção é feita em 2 passos. O anticorpo
primário é ligado ao antígeno específico e depois adiciona-se um segundo anticorpo ligado à
uma enzima que se liga ao anticorpo primário. No ELISA SANDWICH, o anticorpo é fixado
à placa e, posterirormente é adicionado outro anticorpo ligado à enzima para se ligar em um
outro antígeno e formar o complexo. O ELISA por competição é feito de forma que o
antígeno ou anticorpo é fixado à placa e o local de ligação tem a competição do antígeno ou
anticorpo da amostra com um outro pipetado no kit, tal competição faz com que o valor da
leitura seja inversamente proporcional, pois quanto menos quantidade da substância a ser
identificada menos sítios de ligação serão utilizados por elas, os outros sítios de ligação serão
ocupados pelas substâncias que foram adicionadas.

OBJETIVO

Observar a presença de antígeno da proteína X a partir do método ELISA.

MATERIAS E MÉTODOS

Nas primeiras fileiras da placa padrão de ELISA aplicou-se a proteína e solução de

bloqueio diluída de forma seriada. Foi homogeneizado 5 vezes em cada poço e a proteína foi
aplicada e incubou-se a placa por 1h.

Retirou-se a solução e lavou-se por 5 vezes com solução PBS/ TWEEN e então a
placa foi seca. Aplicou-se de anticorpo primário diluído e incubou-se por 1h. Lavou-se
novamente por 5 vezes com PBS/TWEEN e adicionou o anti-anticorpo marcado com enzima
e incubou-se por mais 1h. Adicionou-se o substrato e os pecos foram revelados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O poliestireno é um plástico, constituinte de placas de ELISA, que facilita a adsorsão

de proteínas sobre sua superfície.

A proteína X foi aplicada nos poços seguintes, com menor concentração com o intuito
de diminuir intensidade da coloração e tornar evidente a sensibilidade do teste.

Ao adicionar a IgY, anti-X, espera-se que esse estabeleça interações hidrofóbicas com
a proteína, em sítios de ligação específicos. O tempo de incubação garante a máxima
interação entre o anticorpo e o antígeno e a lavagem, com PBS Tween, remove os compostos
que não se ligaram ou que se ligaram inespecificamente.
 14

O anticorpo secundário, anti-IgY conjugado com peroxidase, complexa-se com o

sistema X-IgY, formado na etapa anterior, o complexo X-IgY-(anti-IgY) formado evidencia
a presença da proteína X na amostra, cuja quantificação é realizada pela leitura
espectrofotométrica da absorbância do sistema, a 450nm. A avaliação no espectro se dá a
partir da degradação do peróxido de hidrogênio, adicionado após a incubação da anti-IgY,
que é o substrato da peroxidase conjugada ao anticorpo secundário. Na tabela 1 vemos o
resultado para a absorbância do padrão e da amostra 8, temos um controle negativo no valor
de absorbância de 0,148 e todos os valores acima dele são considerados positivos.

Tabela 1 – Absorbâncias do padrão e da amostra 8

Concentração (mg/mL) Absorbância padrão Absorbância amostra 8

1,00 1,886 0,882
0,50 1,343 0,482
0,25 0,671 0,309
0,125 0,352 0,224
0,0625 0,217 0,143
0,03125 0,208 0,108
0,015625 0,210 0,093

Como observado na tabela 1, todas as amostras do padrão são positivas e da amostra

8 temos 4 amostras positivas e 3 negativas. Pela imagem 1 também podemos comparar as
duas linearidades através da equação da reta e do valor de R.

Imagem 1 – Curvas do padrão e da amostra 8

Através da imagem pode-se ver que o R da curva padrão é de 0,983, enquanto da

amostra 8 de 0,998, mostrando uma maior linearidade da última em relação ao padrão. Essa
diferença pode ser vista já que quanto mais positiva a amostra maior a presença de anticorpos
específicos para proteína X e na amostra 8 uma baixa presença de anticorpos ao longo da
diluição seriada.

CONCLUSÃO

O método pode ser classificado como válido, uma vez que o sistema X-IgY-(anti-
IgY) foi formado, essa conclusão é evidencia da presença de proteína X. O resultado obtido
indica que o método é sensível e pode ser aplicado na detecção da presença de proteína X,
mesmo em baixas concentrações.
 15

REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS

HHUB. Método Elisa. Disponível em: https://www.hhub.com.br/noticias/metodo-elisa.

Acesso em 27 Jul. 2021.

UFRGS. Teste de Elisa. Disponível em: https://www.ufrgs.br/labvir/material/aulap10.pdf.

Acesso em 27 Jul. 2021.

VITRAL, C. L. ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA). Disponível em:

http://ole.uff.br/wp-content/uploads/sites/236/2017/12/apostila_elisa.pdf. Acesso em: 27
Jul. 2021.

EUROIMMUN. TÉCNICA ELISA. Disponível em:

https://www.euroimmun.com.br/tecnicas/2/elisa#conteudo. Acesso em: 27 Jul. 2021.

DAVIDSON COLLEGE. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay). Disponível

em: https://www.bio.davidson.edu/genomics/method/ELISA.html. Acesso em: 27 Jul. 2021
 16

ANEXOS

Em anexos encontram-se os resultados com imagens da purificação da proteína

9 e também os resultados armazenados para posterior consulta.
 17

Material salvo:

20

16,23,6,31,10,18,3,53500,1,0,0,53500,0,0,10,0.5993667856771007,40,2.5,9.5,126,4,4

22,25,-8,19,26,12,5,320000,4,4,0,50000,30000,0,42,37.90412113853236,60,5,10.5,167,2,2

23,28,8,18,17,16,4,42000,1,0,0,42000,0,0,14,13.76131536447064,50,3.5,10,61,4,4

14,15,3,12,14,7,0,37000,1,0,0,37000,0,0,35,2.0921647943781636,40,4.5,10,139,2,2

12,15,8,15,11,19,1,200000,4,0,0,50000,0,0,20,17.727711237056834,50,3,11,82,3,3

13,15,4,13,11,6,3,32000,1,0,0,32000,0,0,34,2.0405415483526337,40,5,11,81,1,1

24,28,10,20,22,10,0,58000,2,0,0,29000,0,0,15,0.9118428866241378,40,4.5,11.5,105,2,2

9,11,3,15,3,2,0,27000,1,0,0,27000,0,0,49,2.900143519178966,40,5.5,10,199,4,4

7,18,2,16,8,2,0,23000,1,0,0,23000,0,0,24,23.255436056116864,50,4,9.5,141,3,3

16,14,4,13,11,3,1,45000,2,0,0,22500,0,0,34,32.454680801709046,50,3.5,11.5,182,3,3

17,13,2,9,9,4,0,22000,1,0,0,22000,0,0,11,10.772253043771753,50,3,11,167,3,3

20,7,6,12,6,7,0,21000,1,0,0,21000,0,0,21,20.495756179858308,50,4,11,83,7,7

6,7,2,9,12,19,0,20000,1,0,0,20000,0,0,21,1.2245865854576568,40,3.5,10.5,91,2,2

7,14,9,18,2,2,1,140000,2,2,0,50000,20000,0,35,31.070142376694648,50,3.5,10,141,2,2

28,32,36,44,12,12,4,68000,4,0,0,17000,0,0,31,1.8904015252328532,40,4.5,9.5,172,1,1
 18

4,4,3,2,5,2,5,14500,1,0,0,14500,0,0,46,2.6371179868714107,40,5.5,9.5,246,2,2

3,8,3,18,2,3,1,14000,1,0,0,14000,0,0,12,11.292502729058503,50,4,10.5,151,2,2

6,24,4,18,8,6,0,22000,2,0,0,11000,0,0,36,2.201239919453609,40,4.5,9.5,209,1,1

7,12,5,9,3,3,0,11000,1,0,0,11000,0,0,3,2.9410457619285597,50,4,10.5,238,2,2

1,5,0,2,3,2,0,67000,1,0,0,67000,0,0,18,15.834914058383498,60,4,11.5,206,3,3

// Enzyme

// Purification steps so far

// Method, Protein (mg), Enzyme (Units), Enzyme Yield, Enrichment, Cost

0,511,7200,100,1,0

1,499.219807189992,7126.182992404301,98.97476378339306,1.0131029170897001,0.02
8065515608170208

2,308.917271738022,7126.182992404301,98.97476378339306,1.6372054566183352,0.04
209827341225531

2,243.8737940407667,7126.182992404301,98.97476378339306,2.0738638397883538,0.0
56131031216340416

2,243.8737940407667,7126.182992404301,98.97476378339306,2.0738638397883538,0.1
8242585145310636

1,234.0072842988075,6976.630816835059,96.89765023382026,2.115946920962344,0.87
43475411197491

2,234.0072842988075,6976.630816835059,96.89765023382026,2.115946920962344,0.88
86811073676137

2,234.0072842988075,6976.630816835059,96.89765023382026,2.115946920962344,0.90
30146736154785

2,234.0072842988075,6976.630816835059,96.89765023382026,2.115946920962344,0.91
73482398633432