UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

Faculdade de Farmácia de Diamantina

GUILHERME ARAÚJO ANDRADE

JHESSICA JESUS FERNANDES

MARCO JOSÉ FERREIRA REIS

THAÍS AMORIM LIMA

AULA PRÁTICA IV

EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DA CASEÍNA DO LEITE

DIAMANTINA/MG
2023

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO……………………………………………………………………………… 3

REVISÃO DA LITERATURA ..…………………………………………………..………… 3

OBJETIVOS .………………………………………………………………………………… 3

REAGENTES ………………………………………………………………………...……… 4

MATERIAL…………………………………………………………………………………... 4

METODOLOGIA ………………………….………………………………………………... 4

RESULTADOS E DISCUSSÃO..………………………………………………….………… 6

CONCLUSÃO.………………….……………………………………………………………9

REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS.……………………...………………………………………………… 9

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INTRODUÇÃO

A importância em se estudar a proteína caseína presente no leite, se relaciona com o fato desta
ser uma proteína bastante completa (alto valor biológico), pois ela possui todos os aminoácidos
essenciais (aqueles que sua síntese no organismo é inadequada para satisfazer as necessidades
metabólicas e que devem ser fornecidos como parte da dieta). A caseína é a proteína com maior
abundância no leite, para se ter uma ideia, cerca de 80% da proteína encontrada no leite é caseína.
Esse suplemento é obtido através de diversos processos de filtragem.
A caseína é uma glicoproteína que contém 5% de carboidrato e resíduos de fosfoserina, estes
responsáveis por parte significativa do conteúdo de fosfato do leite. Soma-se a isso, a ajuda do
organismo a fornecer aminoácidos e é conhecida como a fonte proteica com digestão mais lenta que
existe. A caseína é produzida a partir da solubilização da caseína do leite. Essa proteína para algumas
pessoas, pode ser de difícil digestão.
Além disso, a metodologia da Reação do Biureto, que é utilizada para a caracterização de
proteínas, pode ser empregada para a quantificação das mesmas mediante a colorimetria. O método se
baseia no fato de que as proteínas (nesse caso, a caseína) formam um complexo violeta com o íon
cúprico (Cu2+) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção a 540 nm. A
coloração violeta apresentada pelo complexo é proporcional à concentração das proteínas na amostra
(leite). Essa reação é positiva para peptídeos constituídos de no mínimo três aminoácidos; assim, a
reação do Biureto será negativa para peptídeos e aminoácidos livres. Tal complexação também ocorre
com o Biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), daí o nome da reação.

REVISÃO DA LITERATURA

De acordo com Lehninger (2011), as proteínas são compostos de diversas cadeias

polipeptídicas associadas não covalentemente, podem ser encontradas em tecidos e células
microbianas.

De acordo com Stryer (2014), as proteínas são macromoléculas muito versáteis, tendo papel
para muitos processos biológicos. Possuem papel de catalisadores, papéis estruturais, enzimáticos,
entre outros fatores importantes para o organismo.

OBJETIVOS

Entender de forma prática toda a teoria que foi administrada em sala de aula sobre função
proteica e como a alteração do seu meio ocorre o surgimento de precipitado.

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 REAGENTES:

● Água destilada;
● Etanol;
● Éter etílico;
● Leite de vaca;
● Ácido clorídrico 5%;
● Reagente de Biureto;
● Solução “filtrado” obtido na primeira parte do experimento;
● Solução de proteína 4 mg/mL.

MATERIAIS:

● Banho de água fervente;

● (1) Bastão de vidro;
● (1) Béquer de 100 ml;
● (1) Pipeta de Pasteur;
● (1) Proveta de 10 ml;
● (2) Pipetas volumétricas de 2 ml;
● (2) Tubos de ensaio grande;
● (1) Funil pequeno;
● (2) Espátulas;
● (3) papel de filtro;
● (2) pipetas graduadas de 5 ml;
● (4) tubos de ensaios pequenos;
● Micropipetas de 200, 100 e 1000 μL;
● Espectrofotômetro e cubeta;
● Ponteiras para micropipetas;
● Grade para tubos de ensaios normal;
● Grade para tubos de ensaios pequenos;
● Balança analítica;
● Guardanapos de papel;
● Pêra pipetadora de borracha.

METODOLOGIA

A extração e quantificação da caseína do leite foi dividida em duas partes, a primeira parte
consistiu na extração e purificação da caseína do leite. Em um recipiente de vidro 100 ml de água

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destilada foi aquecida até a temperatura de 38°C. Em seguida, em um béquer foi adicionado 10 ml da
água destilada anteriormente aquecida e 10 ml de leite de vaca. Foi gotejado aproximadamente 0,5 ml
de HCl a 5% a solução sob agitação com uma pipeta de Pasteur, até iniciar o aparecimento de
precipitado. Após a precipitação ter iniciado, a solução foi deixada em repouso por cinco minutos para
a sedimentação da proteína. Depois dos cinco minutos de sedimentação, foi utilizado um papel de
filtro e um funil acoplado a um tubo de ensaio para realizar a primeira filtração. O filtrado foi
identificado e reservado para a segunda parte do experimento.

O precipitado que foi filtrado e residiu no papel filtro foi raspado para o béquer (o que foi
inicialmente adicionado os 10 ml de água destilada e de leite, e que ficou parte dos resíduos), na qual
foi adicionado e misturado 20 ml de etanol. O mesmo procedimento de filtragem foi aplicado, com a
diferença de descarte do sobrenadante. Os resíduos no papel filtro foram raspados de volta para o
béquer, onde foi adicionado 5 ml de éter etílico e misturado até se dissolver. O mesmo procedimento
de filtragem foi efetuado com o descarte do sobrenadante, enquanto que o precipitado (no caso, a
caseína) no papel filtro que foi anteriormente pesado, secou em temperatura ambiente e em seguida
pesado em uma balança analítica.

A segunda etapa consistiu na dosagem de proteína do leite no filtrado. Em um tubo de ensaio

foi diluído 0,5 ml de leite em 9,5 ml de água destilada, na qual foi agitado até o estado homogêneo.
Quatro tubos de ensaio pequenos foram identificados, conforme a tabela e com o auxílio de uma
micropipeta os seguintes reagentes foram adicionados aos tubos:

Solução Tubo 1 - Branco Tubo 2 - Padrão Tubo 3 - Tubo 4 -

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 Proteínas do Proteínas totais
filtrado

Água
500 μL 200 μL

Solução de
300 μL
proteína 4 mg/ml

Filtrado
500 μL

Leite diluído
500 μL

Reagente de 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL 2,5 mL

Biureto

Em seguida, agitar as soluções para homogeneizar e deixar em repouso por dez minutos a
temperatura ambiente. Com as soluções prontas, foi feita a leitura da absorbância em 540 nm das
soluções dos tubos 2, 3 e 4, ajustando o equipamento com a solução do tubo 1 - o branco. Os valores
das absorbâncias foram anotados e os cálculos realizados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Primeira Parte:

1. Ao adicionar o Ácido Clorídrico (HCl) ao leite, percebeu que houve a formação de um

precipitado, isso pode ser explicado, devido ao fato de que o pH do leite, foi afetado, se
tornando mais ácido, devido a adição do HCl, que consequentemente ocorreu uma
desnaturação das proteínas do leite, gerando o precipitado, sendo necessário a realização de
um filtração
2. Após a primeira filtração, percebeu-se que o sobrenadante, ficou de transparente, além disso
foi necessário reservar esse primeiro sobrenadante da filtração:

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 3. Na segunda filtração, que ocorreu com a adição de Etanol ao precipitado, foi necessário para
poder ocorrer a separação de impurezas polares ao precipitado, que a partir disso realizou-se a
última filtração
4. Na última etapa de filtração, ocorreu a adição de Éter etílico a proteína desnaturada, para
ocorrer a separação de impurezas apolares a amostra, sendo assim foi necessário, a secagem
do precipitado, para podermos observar o rendimento, após a secagem realizou-se a pesagem
da proteína, por seguinte os cálculos de rendimentos a seguir:
Dados:
Massa Papel de Filtro: 0,4522g;
Massa Papel com Proteína: 0,8492g;
Concentração de Leite: 3,2g/100 ml

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 = 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑎𝑝𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 − 𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑎𝑝𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝐹𝑖𝑙𝑡𝑟𝑜

𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 = 0, 8492𝑔 − 0, 4522𝑔
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 = 0, 397𝑔

Quanto de massa há em 10 ml de leite que foram utilizados para prática?

3, 2 𝑔 −−−−−−− 100 𝑚𝑙
𝑥 −−−−−−− 10 𝑚𝑙
𝑥 = 0, 32𝑔
Rendimento:
0, 32𝑔 −−−−−− 100%
0, 397𝑔 −−−−− 𝑥
𝑥 = 124%

O motivo para esse resultado, pode vir a ser devido a erros sistemáticos durante a execução da
prática, tendo em vista que durante a adição dos solventes, para realizar a retirada de compostos
polares, por meio do uso do Etanol, e a retirada de compostos apolares, através do uso do Éter Etílico,
poderia não ter acontecido uma retirada completa e eficaz dos destes componentes devido a filtração.
Entretanto, poderia também não ter ocorrido uma secagem adequada da proteína, sendo assim, como
resultado uma discrepância grande em relação ao peso esperado (teórico) e o peso experimental.

Segunda Parte:

1. Após a fabricação dos tubos com o primeiro sobrenadante, para as análises,

adicionou-se o reagente de Biureto, e esperou passar 10 minutos, para ocorrer a
homogeneização, como está mostrando na foto abaixo:

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 Imagem: Tubos de amostras, 1- Água; 2- Solução de proteína 4mg/ml; 3- Filtrado; 4- Leite
diluído

2. Foi analisado as amostras em um espectrofotômetro, em um comprimento de ondas

de 540 nm, tendo os seguintes resultados de Absorbância (A)

Tubo 2- Padrão Tubo 3- Proteínas do Filtrado Tubo 4-Proteína totais

0,078 nm 0,270 nm 0,600 nm

3. Após isso, podemos realizar os cálculos precisos, para saber a concentração dos
tubos de amostras, tendo em vista que a concentração do padrão (C padrão) é 4
mg/ml:

Equação:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 𝑋 (𝐶 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜/ 𝐴 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜)
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝐹𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏â𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜 𝐹𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑋 (𝐶 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜/𝐴 𝑃𝑎𝑑𝑟ã𝑜)

Cálculos:
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝐿𝑒𝑖𝑡𝑒 = 0, 600 𝑛𝑚 𝑋 (4 𝑚𝑔/𝑚𝑙/0, 078 𝑛𝑚) = 30,77 mg/ml
𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎çã𝑜 𝑑𝑜 𝐹𝑖𝑙𝑡𝑟𝑎𝑑𝑜 = 0, 270 𝑛𝑚 𝑋 (4 𝑚𝑔/𝑚𝑙/0, 078 𝑛𝑚) = 15,23 mg/ml

A partir destes resultados, percebemos que há uma diferença entre os tubos medidos, e o
padrão, possivelmente devido ao fato da solução padrão de proteína ter sido diluída durante a
elaboração dos tubos. Entretanto, a diferença entre o tubo com o filtrado e o tubo com o Leite, pode
ter uma relação direta, devido ao fato de haver tido um processo de retirada da proteína do Leite, a

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Caseína, sendo assim, demonstrando a diferença entre eles, sendo esse valor o valor de uma parcela
que não foi filtrada de forma adequada, ficando um pouco de proteína na solução do filtrado.

CONCLUSÃO:

Portanto, ao final do experimento foi possível concluir que ao se adicionar ácido no leite
houve a desnaturação da caseína e consequentemente a formação de um precipitado na solução, o
qual pode ser quantificado facilmente ao realizar a filtração dessa mistura e esperando-a secar.
Também foi possível concluir que mesmo com a separação da proteína, parte delas não foram retidas
pelo papel de filtro, e consequentemente parte das proteínas ainda puderam ser encontradas no soro.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3935666/mod_resource/content/1/Apostila%20Bioquimica%
202014_LCB%20208.pdf
https://cienciadoleite.com.br/noticia/3678/hidrolise-enzimatica-da-caseina#:~:text=A%20hidr%C3%B
3lise%20enzim%C3%A1tica%20da%20case%C3%ADna,case%C3%ADna)%20e%20uma%20hidrof
%C3%ADlica%20chamada
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/5796557/mod_resource/content/1/RNM%204005%20-%20
%20T16.%20Bioqu%C3%ADmica%20do%20leite%20-%20Eduardo%20Brandt%20de%20Oliveira.
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