INTRODUÇÃO A TÉCNICAS

LABORATORIAIS
ANA VIGO / JOÃO RODRIGUES / MIGUEL SOUSA

LABORATÓRIO INTEGRADO II / BIOENGENHARIA

 Índice
.................................................................................................................................................................. 1

1. SUMÁRIO ............................................................................................................................................. 3

2. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................... 3

3. MATERIAIS E REAGENTES .................................................................................................................... 5

4. FICHA TÉCNICA DO CuSO4 .................................................................................................................... 5

5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ........................................................................................................ 7

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................................. 8

7. CONCLUSÃO ....................................................................................................................................... 15

8. BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................................... 16
 1. SUMÁRIO
A realização deste trabalho laboratorial teve como intuito a aprendizagem do
manuseamento de micropipetas tal como do espectrofotómetro . As micropipetas são
usadas para medir e transferir volumes muito pequenos de amostra de forma precisa.
Embora sejam extremamente úteis na preparação de amostras, quando mal utilizadas
podem transferir volumes imprecisos e ficar descalibradas.
Assim, na primeira parte do trabalho experimental realizámos testes para verificar
a exatidão e precisão da micropipeta.
Numa segunda parte, foram realizadas diversas soluções, por diluição simples e em
série que posteriormente foram comprovadas em espectrofotometria, tendo em conta
a diluição.
Por fim, foi-nos entregue uma solução com concentração desconhecida de soluto,
para que a mesma fosse descoberta através dos valores de absorvância e
concentração das diluições simples e em série realizadas anteriormente.

2. INTRODUÇÃO
Nesta atividade foram utilizadas micropipetas como equipamento de medição
dos volumes necessários para a realização das diluições.
A micropipeta é normalmente usada para medir volumes inferiores a 1 mL.
Estas possuem um botão para controlar o volume de amostra que se pretende pipetar,
um botão para descartar a ponta da micropipeta após a sua utilização e ainda um
êmbolo onde é possível pressionar até duas posições. Ao pressionar gentilmente o
êmbolo até se sentir uma pequena resistência, atingimos a primeira posição, utilizada
para encher a micropipeta com o líquido. A segunda posição consiste em pressionar
com mais força, até não ser possível avançar mais com o pistão e serve para confirmar
o esvaziamento total da micropipeta. Existem vários tipos de micropipetas no que diz
respeito a volumes, dentre elas micropipetas o P100, P200, P1000 e P5000, usadas
para medir volumes de e 10-100 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL e 1000-5000 μL
respetivamente.
Para a realização do procedimento experimental recorreu-se a micropipetas
P100, P200 e P1000 para a medição dos volumes necessários.
Para calcular a energia radiante absorvida (absorvância), foi utilizado um
espectrofotómetro.
O espectrofotómetro é composto por uma fonte luminosa que emite uma
radiação contínua de um certo intervalo de comprimentos de onda. A sua radiação é
focada através de material ótico que inclui um prisma. A intensidade dessa radiação é
medida através de um detetor, antes e depois do feixe luminoso passar pela célula
(normalmente uma cuvette).
A absorvância é uma medida da porção da luz que sai da lâmpada e que realmente
chega a esse detetor. Caso a absorvância seja igual a 1, apenas cerca de 10% da luz
está a atingir o detetor enquanto, quando a absorvância é 2, apenas 1% da luz está a
atingir o detetor. Deste modo, caso os valores de absorvância sejam superiores a 2, os
mesmos não são confiáveis, uma vez que pouca luz está a atingir o detetor. Assim para
permitir medições precisas, deve-se, nesses casos, diluir a amostra e tornar-se a medir
a sua absorvância.
3. MATERIAIS E REAGENTES
• Materiais

- micropipetas P100, P1000 e P5000

- pontas para micropipetas
- copo de vidro 50 mL (1)
- balança analítica
- pipetas graduadas 5, 10 mL
- parafilme
- cuvete de vidro
- espátula
- vidro de relógio (1)
- balão volumétrico 25 mL (1)
- tubos falcon (10)
- tubos de ensaio (20)
- pompete

• Reagentes

- água destilada
- sulfato de cobre (CuSO4)
- solução de sulfato de cobre de
concentração desconhecida

4. FICHA TÉCNICA DO CuSO4

• Propriedades
Formula molecular: CuSO₄
Massa molar: 249,7 g /mol
Aparência: sólido, azul
Ponto de fusão: 30 – 110 °C
pH: 3,5 – 4,5
Densidade: 2,286 g /cm³

• Pictogramas (figura 1; figura 2; figura 3)

Figura 1 - Irritante Figura 2 – Perigo para

Figura 3 - Perigo de
o ambiente.
corrosão.
 • Advertências de perigo

H302 Nocivo por ingestão

H318 Provoca lesões oculares graves
H410 Muito tóxico para os organismos aquáticos com efeitos duradouros

• Advertências de prudência

P273 Evitar a libertação para o ambiente

P280 Usar luvas de proteção/proteção ocular
 5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
PARTE A
- Escolheu-se duas micropipetas e as respetivas pontas.
- Colocou-se na micropipeta o volume correto que se pretendia pipetar. Para cada
micropipeta pretendeu-se verificar a sua exatidão e precisão em toda a sua gama de
volumes, testando-se para isso pelo menos dois volumes diferentes.
- Colocou-se o copo de vidro na balança e tarou-se de modo que o seu peso fique em
zero.
- Pipetou-se com a micropipeta o volume de água destilada desejado e deitou-se no
copo de vidro.
- Registou-se o peso da água destilada medido.
- Repetiu-se o procedimento mais nove vezes.

PARTE B
- Preparou-se, num balão volumétrico, 25 mL de solução de CuSO4 1,0 mol/L. Colocou-
se num tubo falcon e identificou-se.

I – Diluições simples
- Num tubo de ensaio preparou-se em duplicado, com água destilada, 6 mL das
seguintes diluições da solução de CuSO4 1,0 mol/L : 1:2, 1:5, 1:10, 1:50 e 1:100.
- Registou-se os volumes pipetados de solução de CuSO4 1,0 mol/L e de água destilada.

II – Diluições sucessivas ou em série

- Em tubos falcon preparou-se em duplicado 10 mL das soluções seguintes de CuSO4
por diluição em série da solução de CuSO4 1,0 mol/L : 1:5, 1:25, 1:125 e 1:625.
- Registou-se os volumes pipetados de solução de CuSO4 e de água destilada.

III – Experiência de aplicação

- Preparou-se 4 diluições diferentes, em duplicado, da solução de CuSO4 de
concentração desconhecida.
- Registou-se os volumes pipetados de solução de CuSO4 e de água destilada.
 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
PARTE A - Precisão e exatidão de micropipetas

Para testar a precisão e a exatidão das micropipetas foram pipetados dois

volumes cerca de dez vezes para cada uma delas. Em Excel foram calculados os valores
respetivos à média, desvio padrão, desvio padrão relativo, erro relativo em % e desvio
padrão absoluto para cada volume. Os valores foram registados na tabela 1.

Micropipeta 1000 μL Micropipeta 5000 μL

V(pipetado) V(pipetado) V(pipetado) V(pipetado)

500 μL 1000 μL 3500 μL 5000 μL

0,44 g 1,18 g 4,33 g 5,74 g

0,41 g 1,19 g 4,32 g 5,78 g

Massa 0,47 g 1,19 g 4,28 g 5,76 g

Pipetada
0,48 g 1,18 g 4,25 g 5,82 g

0,48 g 1,17 g 4,28 g 5,81 g

0,46 g 1,17 g 4,29 g 5,76 g

0,47 g 1,18 g 4,24 g 5,81 g

0,47 g 1,18 g 4,28 g 5,76 g

0,46 g 1,18 g 4,31 g 5,77 g

0,47 g 1,18 g 4,26 g 5,78 g

Média 0,47 g 1,18 g 4,29 g 5,78 g

Desvio padrão 0,020224 g 0,006325 g 0,029 g 0,02508 g

Desvio padrão 4,30 g 0,535979 g 0,67757 g 0,434284 g

relativo
Erro relativo 6 18 22 16
(%)

Desvio padrão 0,021318 g 0,006667 g 0.030569 g 0,026437 g

absoluto
Tabela 1 - Precisão e exatidão de micropipeta

Os valores obtidos estão, em todos os casos, díspares do valor real, o que os

torna pouco exatos. Tais conclusões são confirmadas pelo erro relativo uma vez que
este é elevado em todos os casos, revelando um caráter classificado entre fraco e mau.
Por outro lado, em cada volume pipetado, os valores obtidos encontram-se próximos
uns dos outros, tornando-os assim, valores precisos. Os valores do desvio padrão
reforçam essa vertente, uma vez que se encontram <0,1. Concluindo-se, no que diz
respeito à precisão, valores muito bons.
Os valores pouco exatos podem dever-se a erros sistemáticos e experimentais,
tais como a presença de bolhas de ar nas pontas das micropipetas na realização das
medições, manuseamento incorreto da micropipeta ou má calibração da balança.

PARTE B – Preparação de soluções por diluição

Cálculos experimentais
1) Determinação da massa de CuSO4 necessária a pesar para a realização
das diluições.
𝑚
Através da expressão 𝑐 = 𝑉 , conseguimos o valor da massa real da amostra.

25 𝑚𝐿 = 0,025 𝐿 𝑀(𝐶𝑢𝑆𝑂4) = 249,69 𝑔/𝑚𝑜𝑙 𝑐 = 0,025 𝑚𝑜𝑙/𝐿

𝑚 = 0,025 × 249,69 = 6,242 𝑔

Tendo em conta que a substância tem um grau de pureza de 96,34 %, então a

massa necessária será:

GP (%) = 96,34 %

𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑢𝑟𝑎
𝐺𝑃 = 96,34 %  ⟺   × 100 = 96,34 ⟺ 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑝𝑢𝑟𝑎
𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑟𝑒𝑎𝑙
= 6,01 𝑔  

Assim, com o valor da massa de CuSO4 podemos realizar as diluições de acordo

com a concentração necessária.
 2) Determinação do Vamostra a pipetar para cada diluição

O volume necessário a calcular é obtido pela expressão 𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2 , dado

que o volume total é 6 mL, a concentração inicial 1 mol/L e a concentração final dada
pelas razões 1:2, 1:5, 1:10, 1:50 e 1:100 nas diluições simples e dado que o volume
total é 10 mL, a concentração inicial 1 mol/L e as razões da concentração final 1:5,
1:25, 1:125 e 1:625 nas diluições em série, torna-se possível calcular o Vamostra para
cada um.

Assim,

1:2 = 0,5 𝑉1 = 0,5 × 6 = 3 𝑚𝐿 1:5 = 0,2 𝑉1 = 0,2 × 6 = 3 𝑚𝐿

1:5 = 0,2 𝑉1 = 0,2 × 6 = 1,2 𝑚𝐿 1:25 = 0,04 𝑉1 = 0,04 × 6 = 3 𝑚𝐿
1:10 = 0,1 𝑉1 = 0,1 × 6 = 0,6 𝑚𝐿 1:125 = 0,008 𝑉1 = 0,008 × 6 = 3 𝑚𝐿
1:50 = 0,02 𝑉1 = 0,02 × 6 = 0,12 𝑚𝐿 1:625 = 0,0016 𝑉1 = 0,0016 × 6 = 3 𝑚𝐿
1:100 = 0,01 𝑉1 = 0,01 × 6 = 0,06 𝑚𝐿

I) Diluições simples

Para cada concentração é possível então calcular o volume de solvente (água

destilada), tendo em conta o de soluto (𝐶𝑢𝑆𝑂4 ), crucial para cada diluição. Todas as
diluições foram realizadas duas vezes, sendo o valor da absorvância a média dos dois
valores obtidos. Os valores encontram-se na Tabela 2.

Diluição Vamostra(mL) Vágua(mL) VTotal(mL) DO (700 nm)

1:2 3,0 3,0 6,0 3

1:5 1,2 4,8 6,0 1,69

1:10 0,6 5,4 6,0 1,325

1:50 0,12 5,88 6,0 0,0825

1:100 0,06 5,94 6,0 0,049

Tabela 2 - Diluições Simples

Os valores da absorvância são menores com o aumento da diluição, tal como o

esperado.
 Com os valores obtidos da absorvância é possível construir graficamente a
variação da mesma com a concentração de cada diluição como mostra o Gráfico 1.

Diluições simples
3,5
3
2,5
ABSORVÂNCIA

2
1,5
1
0,5
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
CONCENTRAÇÃO

Gráfico
Tabela1 3- Variação
- Variaçãodadaabsorvância
absorvânciacom
coma aconcentração
concentraçãocorrespondente
correspondenteàsàsdiluições
diluições
simples simples

Atendendo à tabela, conseguimos calcular o valor do coeficiente de extinção

molar de cada diluição.
O coeficiente de extinção molar é dado pela equação 1.

𝐴
𝜀=
𝐶×𝑙
Equação 1 - Cálculo do coeficiente de extinção molar

No qual, A corresponde ao valor de absorvância, C ao valor de concentração e l

ao comprimento do caminho ótico, que no caso é 1 cm. Assim, através da equação 1 o
coeficiente de extinção molar pode ser calculado, tal como representado na Tabela 3.

Diluição Absorvância Concentração Coeficiente de extinção

molar

1:2 3 0,5 6

1:5 1,69 0,2 8,45

1:10 1,325 0,1 13,25

1:50 0,0825 0,02 4,125

1:100 0,049 0,01 4,9

Tabela 3 - Valores relativos ao coeficiente de extinção molar das diluições simples

 II) Diluições em série

Para a preparação das diluições em série foi igualmente necessário calcular o

volume de solvente (água destilada) tendo em conta o calculado de soluto (𝐶𝑢𝑆𝑂4 ).
Todas as diluições foram realizadas duas vezes sendo o valor da absorvância a
média dos dois valores obtidos (Tabela 4).

Diluição Vamostra(mL) Vágua(mL) VTotal(mL) DO (700 nm)

1:5 2,0 8,0 10,0 1,125

1:25 2,0 8,0 10,0 0,255

1:125 2,0 8,0 10,0 0,0545

1:625 2,0 8,0 10,0 0,0105

Tabela 4 - Diluições em série

Podemos concluir uma descida do valor da absorvância com o aumento da

diluição tal como nas diluições simples, sendo isto o esperado.
Com os valores obtidos da absorvância é possível construir graficamente a
variação da mesma com a concentração de cada diluição como mostra o Gráfico 2.

Diluições em série
1,2

1
ABSORVÂNCIA

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
CONCENTRAÇÃO

Gráfico 2 - Variação da absorvância com a concentração correspondente às diluições

em série.

Da mesma forma, conseguimos calcular o valor do coeficiente de extinção

molar de cada diluição através dos valores da Tabela 5.
 Diluição Absorvância Concentração Coeficiente de

extinção molar

1:5 1,125 0,2 5,625

1:25 0,255 0,04 6,375

1:125 0,0545 0,008 6,8125

1:625 0,0105 0,0016 6,5625

Tabela 5 - Valores relativos ao coeficiente de extinção molar das diluições em série

III) Experiência de aplicação

Foi-nos fornecida uma solução de CuSO4 de concentração desconhecida com o

objetivo da mesma ser descoberta. Desta forma, calculamos os valores respetivos ao
volume, para a realização das duas diluições, para o futuro cálculo da absorvância
(Tabela 6).

Diluíção Vamostra(mL) Vágua(mL) VTotal(mL) DO (700 nm)

1:1 3 0 3,0 1,9135

1:2 1,5 1,5 3,0 0,7005

Tabela 6 - Diluições da experiência de aplicação

Para obter o valor da concentração de CuSO4, sendo que esta é desconhecida, é

necessário obter a equação da reta correspondente à soma das retas dos gráficos 1 e
2. O gráfico 3 representa a reta resultante dos gráficos 1 e 2.
 Experiência de aplicação
3,5

2,5
Absorvância

1,5

0,5

0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Concentração

Gráfico 3 - Variação da absorvância com a concentração das diluições simples +

diluições em série

O valor da concentração pode ser dado com o desenvolvimento da equação da

reta do Gráfico 3.
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏

Para calcular o m são utilizados dois pontos da reta, no caso A (0,04;0,255) e B

(0,01;0,049) respetivamente.
𝑦2 − 𝑦1
𝑚=
𝑥2 − 𝑥1

0,255 − 0,049
𝑚= ⟺  𝑚 = 6,87
0.04 − 0.01

𝑏 = 𝑦 − 𝑚𝑥

𝑏 = 0,255 − 6,87 × 0,04  ⟺  𝑏 = −0,02

Desta forma, com os valores de m e b é possível calcular o valor da

concentração da solução desconhecida.

1,9135 = 6,87𝑥  − 0,02  ⟺  𝑥 = 0,281

0,7005 = 6,87𝑥  − 0,02  ⟺  𝑥 = 0,105

 7. CONCLUSÃO
Com a parte A deste trabalho, conclui-se que obtivemos valores pouco exatos,
mas precisos na testagem das micropipetas. Ao longo das medições poderão ter
surgido alguns erros experimentais e sistemáticos, tais como o mau manuseamento da
micropipeta e a presença de bolhas de ar na ponta da mesma que afetaram os
resultados.
De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que a concentração da
solução de concentração desconhecida é de 0,281 mol/L. No entanto, reparamos que
certos valores da absorvância deram diferentes para a mesma diluição, o que pode ter
prejudicado os resultados. O mesmo pode dever-se aos tais erros experimentais e
sistemáticos relativos à micropipeta.
 8. BIBLIOGRAFIA
https://www.fq.pt/tabelas/massa-volumica-da-agua

Protocolo Trabalho 1