Biologia Molecular

Prof. Melissa Cordeiro

Alunos:_____________________________________________________________________
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Data:________________________ Turma:____________________ Nota: ____________

AULA PRÁTICA
Micropipetagem e obtenção de soluções em concentrações desejadas
Objetivos:

• Utilizar corretamente micropipetadores;

• Calcular concentrações específicas a partir de soluções estoque.

1. Conversões métricas
As unidades de medidas de líquidos mais utilizadas na Biologia Molecular são mililitro (ml) e microlitro
(µl).

Litro L
Decilitro dL 1 x 10-1 (0,1 L)
Mililitro mL (cm3) 1 x 10-3 (0,001 L)
Microlitro µL (mm3) 1 x 10-6 (0,000001 L)

Atividade 1. Converta em microlitros:

a) 0,5 mL
b) 1 L
c) 6,3 mL

2. Micropipetadores

Equipamento com função de realizar a medição de líquidos com precisão. Tem a capacidade de medir
volumes muito pequenos chegando até a 0,1µL, ou seja, um décimo de milésimo de mililitro, ou um
décimo milionésimo de um litro.
O volume a ser aspirado é ajustado girando-se o calibrador de volume do pistão até o volume desejado.
Apertando-se o êmbolo, o volume especificado de ar é removido do pistão; quando se libera o êmbolo,
cria-se um vácuo que aspira igual volume de líquido para dentro da ponteira. O líquido aspirado pode ser
então expelido apertando-se o êmbolo novamente
A amplitude de volumes medidos pelos micropipetadores varia entre modelos e os fabricantes.
Existem diversos modelos de micropipetas. Elas podem ser divididas em micropipetas mecânicas
monocanal (apenas uma saída para dispensação de líquidos.), multicanal (diversas saídas para
dispensação de líquidos, geralmente com 8 ou 12 canais) e micropipetas eletrônicas (Dispensação
automatizada que permite realizar diversas programações).
A inexatidão (erro sistemático) e a imprecisão (erro aleatório) são os problemas nas práticas de
micropipetagem em laboratórios de biologia molecular.
Os seguintes cuidados devem ser tomados ao manusear um micropipetador:
1. Nunca gire o calibrador de volume acima dos limites superiores e inferiores de volume do
micropipetador.
2. Nunca mergulhe o micropipetador num líquido sem a ponteira, pois isso prejudica o pistão.
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3. Nunca inverta ou deite o micropipetador com líquido na ponteira, pois o líquido pode ir para dentro
do pistão.
4. Nunca solte o êmbolo rapidamente após expelir o fluido, pois isto danifica o pistão.
5. Nunca reutilize uma ponteira que já foi utilizada para pipetar um reagente diferente.
6. O ajuste do volume deve ser feito antes do encaixe da ponteira. Ao encaixar a ponteira observar a
perfeita conexão com o cone.
7. Ao utilizar a ponteira pela primeira vez, deve ser realizada a ambientação, isto é, aspirar e dispensar
a amostra algumas vezes antes da aspiração definitiva, esse processo irá condicionar a parte interna
da potenteira.
8. Não mergulhe completamente a ponteira no líquido a ser pipetado, nunca mais de 1cm. A ponteira
deve ser imersa entre 1-2mm, para pipetas de volume menor, e até 3-6mm para pipetas de volumes
maiores.
9. O ângulo de imersão da ponteira deve ser o mais vertical possível.
10. O descarte da ponteira deve ser sempre realizado utilizando o botão ejetor.
11. Recomenda-se dispensar o líquido com a extremidade da ponteira contra a parede do recipiente.
Esta técnica pode aumentar a precisão em 1% ou mais.
12. Deixe que os líquidos e equipamentos fiquem em temperatura ambiente antes de iniciar a
pipetagem. Trabalhar em temperatura constante minimiza variações do volume pipetado.
13. Segure livremente a micropipeta, e guarde-a enquanto não estiver utilizando. O calor do corpo
transferido durante a pipetagem altera o equilíbrio de temperatura, que pode levar a variações de
volume.

Atividade 2. Treinamento de micropipetagem.

Escolha a micropipeta adequada e transfira os volumes abaixo de água para um microtubo. Quais
pipetas foram escolhidas para a pipetagem de cada volume?
a) 24 µL:
b) 110 µL:
c) 734 µL:

Atividade 3. Treinamento de micropipetagem com líquidos viscosos

Transfira 150µL da solução viscosa para um microtubo. Observe se ficou uma gota do líquido na ponta
da ponteira, ou seja, o volume expelido foi menor que o valor alvo. Como evitar tal situação?

Atividade 4. Solução em concentração (mol/L) desejada

Como preparar 500mL de uma solução de NaOH 0,5mol/L?

Atividade 5. Simulação de diluição.

Considere que a solução I possui concentração de 0,6mM. Como preparar 200ul dessa solução a uma
concentração de 0,15mM?

Atividade 6. Cálculo de concentração.

Ao adicionar uma quantia de 75µL de água diretamente em 25µL de uma solução 0,2mM de cloreto de
sódio (NaCl), qual será a concentração final obtida?
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Atividade 7. Cálculo de concentração.
Deseja-se preparar 500 µL de uma solução a 0,007%. Se a solução estoque está na concentração de 1%
quanto se deveria utilizar da solução estoque?

Atividade 8. Simulando uma reação.

1. Use uma caneta marcadora para identificar 3 microtubos de 1,5mL, chamando-os de A, B e C.
2. Utilize a tabela abaixo como lista de tarefas para adicionar as soluções a cada um dos tubos.

Tubo Solução I Solução II Solução III Solução IV

(tampão)
A 110 µL 35 µL 55 µL
B 145 µL 35 µL 20 µL
C 100 µL 27 µL 43 µL 30 µL

3. Ajuste o micropipetador apropriado e adicione a solução I a cada tudo de reação como indicado
na tabela.
4. Com o micropipetador apropriado adicione a solução II aos tubos A e C.
5. Adicione a solução III aos tubos B e C. Repita para a solução IV.
6. Feche as tampas dos tubos, coloque os tubos na microcentrífuga e aplique um pulso curto de
alguns segundos (spin down). Coloque os tubos no rotor da centrífuga numa posição equilibrada.
7. Um total de 200 µL de reagentes foi adicionado em cada tubo. Verifique a precisão de suas
medidas, ajustando o micropipetador P200 para 200 µL e retirando cuidadosamente a solução
de cada tubo.
8. A ponteira ficou completamente cheia? Ficou líquido no tubo? Existe ar na extremidade da
ponteira, após enchê-la com a solução? (O volume que faltou para encher a ponteira pode ser
calculado rodando o calibrador de volume para expulsar todo o ar e trazer o líquido para a
extremidade da ponteira).
9. Repita o exercício até conseguir resultados precisos.
10. Quantas repetições foram necessárias?

Responda:
Considerando que a solução I possui concentração de 5mM, qual a concentração dessa solução nos tubos
A, B e C?

Questões para discussão:

1. Por que os microtubos precisam estar equilibrados no rotor da microcentrífuga?

2. Diferencie inexatidão de imprecisão. Cite três boas práticas para evitar erros de
pipetagem.