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METROLOGIA

Micropipetas

As micropipetas são instrumentos volumétricos utiliza-


dos para a medição de um determinado volume de líquido
quando são necessários valores na ordem dos micro-
litros. São instrumentos de medição muito importantes
em áreas como a química, biologia, saúde, farmácia e
genética, que trabalham com o doseamento volumétrico
em pequena escala. Existem dois tipos de micropipetas:
as micropipetas de deslocamento positivo utilizadas para
líquidos específicos e as de deslocamento de ar, sendo
estas últimas as mais utilizadas em laboratórios.

O princípio da operação de pipetagem é simples: o


enchimento das micropipetas é realizado através dum
êmbolo accionado manualmente que aspira o líquido
de calibração. A quantidade de ar entre o êmbolo e a
pipeta determina o volume pretendido. O mesmo êmbolo
também provoca o escoamento do líquido por impulsão
do ar.

Calibração

IMPORTÂNCIA DA
Acalibração de micropipetas consiste na determinação
do volume escoado de uma micropipeta através do
método gravimétrico, utilizando água como líquido de

CALIBRAÇÃO
calibração, à temperatura de referência de 20ºC, utili-
zando fórmulas adequadas, e que permite obter o erro
volumétrico associado à micropipeta.

DE MICROPIPETAS O procedimento experimental é baseado na norma ISO


8655(1) e consiste em efectuar cinco enchimentos suces-
sivos de forma a que a micropipeta atinja o equilíbrio de

NOS ENSAIOS ANALÍTICOS humidade. Muda-se de seguida a ponta e faz-se um novo


enchimento. Determina-se o peso do recipiente com 3mm
de água e pipeta-se o volume pretendido. Pesa-se o
A medição de volume é um passo crítico em qualquer recipiente com água e, por diferença, determina-se o
laboratório analítico, especialmente quando se trabalha valor do volume da micropipeta. Repete-se os ensaios
10 vezes sem limpar o recipiente. Em cada medição
em ensaios muito sensíveis onde existem poucas
deve-se registar o valor da massa. O valor médio dos 10
quantidades de amostra a analisar e onde um pequeno ensaios corresponde à massa escoada da micropipeta.
erro de pipetagem pode causar um erro bastante
Para se determinar qual o volume correspondente à
significativo no resultado. Para se conseguir identificar
massa escoada da micropipeta utiliza-se a seguinte
e corrigir erros provenientes do manuseamento de fórmula descrita na ISO 4787(2):
líquidos é essencial a calibração dos instrumentos
volumétricos nas mesmas condições em que são
utilizados no laboratório.
Elsa Batista
Laboratório de Volume Nesta equação temos:
Instituto Português da Qualidade
V20 – volume, à temperatura de 20ºC, em µl;

38 QUALIDADE EM SAÚDE
METROLOGIA

IL – resultado da pesagem com o recipiente cheio com que descreve como a grandeza V20 é influenciada pelas variações
água, em mg; de cada um dos componentes da fórmula utilizada.
IE – resultado da pesagem com o recipiente vazio, em
mg; Assim, a fórmula de cálculo da incerteza padrão é a seguinte:
ρW – massa volúmica da água, à temperatura de cali- A incerteza padrão é de seguida multiplicada por um factor de
bração t, em mg/µl; conversão k (normalmente é 2 para um número de graus de
ρA – massa volúmica do ar, em mg/µl (para temperaturas
muito próximas de 20ºC e à pressão atmosférica
normal pode ser usado o valor médio de 0,0012
mg/µl);
ρB – massa volúmica de referência das massas da
balança (para massas conformes com a OIML 33,
normalmente utilizados, este valor é de 8,0 mg/µl);
γ – coeficiente de expansão cúbica do material de que liberdade superior a 50) para se obter a incerteza padrão expandida
é constituída a micropipeta, em ºC–1; que corresponde a um intervalo de confiança de 95%.(6)
t – temperatura da água usada na calibração, em ºC.
Assim, o resultado final da calibração irá ser representado por:
A temperatura do líquido de calibração é um elemento V20= Volume ± Incerteza
essencial para o cálculo do volume, uma vez que a sua
variação implica a obtenção de diferentes valores de Variação do erro
densidade. Assim, é de extrema importância que o líquido
de calibração se encontre à temperatura de trabalho Asoma do módulo do erro obtido (diferença entre o volume nominal
do laboratório para que os valores obtidos na calibra- e o volume convencionalmente verdadeiro) com o módulo da
ção possam ser utilizados no decorrer de ensaios incerteza deverá ser igual ou inferior à tolerância do instrumento
laboratoriais. Atemperatura de referência deverá ser de indicada na norma ISO 8655, de forma a que o instrumento possa
(20 ± 0.5)ºC. O líquido de calibração deverá ser água ser utilizado nos ensaios a que se destina.
destilada com uma condutividade inferior a 5 µS/cm(3).
Testes de desempenho
Cálculo da incerteza
O erro volumétrico obtido na calibração da micropipeta pode ser
A incerteza de medição é o parâmetro associado ao alterado indevidamente (invalidando todo o processo de calibração)
resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão devido a vários factores de manuseamento deficiente do material,
dos valores que podem ser razoavelmente atribuídos tais como um mau funcionamento do êmbolo causado pela fadiga
à mesuranda(4). Para calcularmos a incerteza do volume da mola da micropipeta ou erros associados ao tipo de ponta, entre
escoado temos de ter em conta os factores que vão outros.
influenciar essa medição ou seja os componentes de
incerteza. Assim sendo, foram efectuados dois tipos de ensaios de desem-
penho a uma micropipeta de 1000 µl para se avaliar a sua resposta
O cálculo da incerteza na calibração de micropipetas é em condições específicas e como isto pode influenciar o volume
semelhante ao descrito no trabalho de E. Batista et.al., escoado: o ensaio das pontas e o ensaio de fadiga. No primeiro
Metrologia 2000(5). Neste caso específico as componen- caso a micropipeta foi calibrada sempre com a mesma ponta cinco
tes da incerteza vão ser as seguintes: vezes. No caso da fadiga foram realizadas 100 medições conse-
cutivas, 10 testes com 15 minutos de intervalo e cinco testes com
a incerteza da pesagem (um) 24 horas de intervalo. Cada teste possui 10 medições.
a incerteza da massa volúmica da água (uρw),
dos pesos da balança (uρB) e do ar (uρA) Os resultados obtidos(7) estão indicados nas figuras da página
a incerteza da temperatura (ut) seguinte.
a incerteza da evaporação (uevap)
a incerteza do coeficiente de expansão cúbica Como se pode observar pelas figuras, no ensaio de fadiga a
do material (uγ) micropipeta necessita de algum tempo para recuperar depois de
Para se obter a incerteza padrão multiplica-se cada ser utilizada continuamente. O volume vai diminuindo ao longo das
componente pelo respectivo coeficiente de sensibilidade, 100 medições (figura 1) possivelmente devido a um problema mecâ-

N.11 - JULHO/SETEMBRO 2004 39


METROLOGIA

nico de aspiração do líquido, o êmbolo não consegue voltar à posi-


ção inicial. Por outro lado, se houver um intervalo de 15 minutos de
espera (figura 2) entre 10 medições consecutivas, a micropipeta já
tem tempo para recuperar e o problema mecânico é suprimido, o
mesmo acontece se o intervalo de espera for de 24 horas (figura 3),
mas como é óbvio este tempo de espera não é viável em labo-
ratórios analíticos.

Para o ensaio das pontas (figura 4) verifica-se que se a mesma ponta


for utilizada em todas as medições não existe alteração de volume,
mas é mais seguro proceder à substituição da ponta em cada medi-
ção porque, se existir algum defeito de fabrico que possa influenciar
o resultado, pode não ser identificado durante os ensaios. Outro
problema que pode ocorrer se não houver substituição de pontas é
o da contaminação no caso de medições químicas ou biológicas.

Conclusão

Acalibração das micropipetas é de muita importância para os testes


analíticos, pois permite verificar quais os erros e incertezas asso-
ciados ao material utilizado, sendo assim possível a correcção do
volume doseado nas análises realizadas, obtendo-se um resultado
final mais correcto e realista.

Por outro lado, uma utilização cuidada das micropipetas também é


importante, visto que os testes de desempenho indicam claramente
que as micropipetas não devem ser usadas continuamente sem
nenhum intervalo de espera devido à fadiga do êmbolo que irá levar
a resultados de medição de volume incorrectos. Recomenda-se
assim um intervalo de espera de pelo menos 15 minutos entre 10
medições consecutivas se a precisão do resultado for importante
na medição de volume.

Através do teste das pontas pode-se concluir que é melhor utilizar


diferentes pontas em cada medição para evitar contaminações e
identificar problemas de construção da ponta.

Bibliografia
[1] ISO 8655-1/2/6, 2002 – Piston-operated volumetric apparatus;
[2] ISO 4787, 1984 – Laboratory glassware - Volumetric glassware - Methods
for use and testing of capacity;
[3] Guia Relacre – Calibração de material volumétrico, 1995;
[4] VIM – Vocabulário Internacional de Metrologia, IPQ (1996);
[5] E. Batista, A. Sabrosa, M. Ferreira, I. Castanheira, A.M.H. Van der Veen –
"Uncertainty calculation in the calibration of volumetric laboratory glassware",
Congresso de Metrologia, Brasil, 2000;
[6] BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML– Guide to the expression of
uncertainty in measurement (GUM), Geneva, 1995;
[7] E. Batista, L.Pinto, E. Filipe, A.M.H. Van der Veen – "Calibration of micro-
pipettes: test methods and uncertainty calculation", Congresso de Metrologia,
Toulon, 2003.

Agradecimentos
AEduarda Filipe e Luís Pinto o permanente apoio e disponibilidade na elabo-
ração deste artigo.

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