PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS

ILACVN – UNILA
DISCIPLINA: FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA
Profa. Aline T. Toci

AULA PRÁTICA: DETERMINAÇÃO DE CAFEÍNA E TRIGONELINA EM AMOSTRAS DE CHÁ

E CAFÉ

Objetivo: Determinar o teor de cafeína e trigonelina em amostras de café descafeinado e integral euma
amostra de chá.

1 Local de aplicação
Laboratório de Cromatografia e métodos ópticos que fazem parte do LEAM

2 Segurança
Antes de iniciar qualquer atividade dentro do laboratório o analista deve:
• Fazer uso dos EPI e vestir adequadamente.
• Evitar realizar atividades inapropriadas.

3 Equipamentos
• Chapa aquecedora
• Balança Analítica
• Centrifuga
• Cromatógrafo em fase líquida de alta performance (CLAE).

4 Materiais
• Água ultrapura • Pipeta automática de 1 mL
• Solução Saturada de Acetato de Chumbo • Papel filtro
• 9 Erlenmeyers de 125 mL • Funil de vidro de 50 mm
• 9 balões volumétricos de 100 mL • Tubo cônico tipo Falcon de 50 mL
• 9 balões volumétricos de 5 mL • 3 Filtros de 0,22 µm hidrofílicos
• Pipeta automática de 5 ml • 9 Seringas
• 9 Vials de 2 mL • Etiquetas

5 Amostras
• Amostra de café descafeinado em pó
• Amostra de café em pó
• Chá verde

6 Procedimento de laboratório

Inicialmente aquecer 450 mL de agua ultrapura na chapa a 90°C.

Extração da cafeína e clarificação.

Pesar em triplicata cerca de 0,20 g da amostra em erlenmeyer de125 mL.

Adicionar aproximadamente 50 mL de água ultrapura a 90C, agitar manualmente por 1 minuto e deixar
em repouso ate esfriar a temperatura ambiente (aproximadamente 5 minutos).
Transferir para um balão volumétrico de 100 mL, filtrando a solução com papel de filtro.
Com o auxilio de uma pipeta automática de 5 mL adicionar 2,0 mL de solução aquosa saturada deacetato
de chumbo básico (CH3COO)2 Pb.Pb (OH)2.
Aferir o balão, homogeneizar e transferir para tubo Falcon de 50 mL.
Centrifugar a solução por 5 minutos a 3000 rpm.

Diluição da amostra

Com auxilio de pipeta automática de 1 mL transferir 0,5 mL do sobrenadante contido no tuboFalcon

para um balão volumétrico de 5 mL.
Completar o menisco com agua ultrapura e homogeinizar.
Filtrar a solução com filtro hidrofílico para um tubo vial de 2 mL.

Análise Cromatográfica

Coluna: Ace 5 C18(5.0 μm, 250 x 4.6 mm i.d.), coluna de guarda Ace 5 C18 (3.0, 4.0 and 4.6 mm).
Gradiente de eluição: A fase móvel será constituída de dois solventes, solvente A (metanol) e solvente B
(água), em eluição gradiente: 0 min (5% A), 4 min (15% A), 5 min (25% A), 6 min (35% A), 7 min (40% A), 12
min (35% A), 13 min. Fluxo a 1,0 mL min-1.
Temperatura do forno: 30 °C
Volume de injeção: 100 µL
Detector: DAD (Diode Array Detector), com comprimento de onda de 272 nm (cafeína) e 265 nm
(trigonelina).

7 Quantificação

Quantificar os teores de cafeína e trigonelina por comparação da área dos picos dos componentes nas
amostras com área dos picos referentes ao padrão externo previamente com concentrações de 3 g/ml e 31 g/ml,
para a cafeína e trigonelina, respectivamente. A curva analítica para a quantificação será realizado previamente pelo
técnico. As tabelas 2 e 3 apresentam os valores das áreas dos picos para os pontos das curvas dos padrões externos
de cafeína e trigonelina.

Concentração (ug/mL) Área Concentração (ug/mL) Área

0,5 0,4785 0,10 0,0423
2,5 2,4015 0,25 0,1009
5,0 4,7801 0,50 0,2386
7,5 7,1238 1,50 0,6171
10 9,3143 3,50 1,4514
20 18,3433 5,00 2,0525
Tabela 2. Curva Analítica da Cafeína Tabela 3. Curva Analítica da Trigonelina

8 Itens para constar no relatório:

- Introdução, objetivo, parte experimental, resultados e discussão, conclusão e referencias.
- Carga de amostra
- Rampa representando o gradiente de eluição
- Sugestão do que seria possível para modificar a eluição (apresentar cálculos quando necessário)
- Limites de quantificação e detecção
- Curva analítica
- Teores de cafeína e trigonelina nas amostras
- Comparação dos resultados com a literatura

9 Referencias

TOCI, Aline; FARAH, Adriana; TRUGO, Luiz Carlos. Efeito do processo de descafeinação com
diclorometano sobre a composição química dos cafés arábica e robusta antes e apos a torração.
QuímicaNova, Rio de Janeiro, v. 29, n. 5, p. 965-971, jan./jul. 2006.