Disciplina de Análise Instrumental I

Laboratório: Análise Instrumental (Lab. 313)

Prática: Determinação de Cafeína e teobromina por HPLC em fase reversa

Professores: Ana Luísa de Queiroz Baddini e Leila Pontes da Silva

Data da realização da prática: 03/06/2023

Data de entrega do relatório: 17/06/2023

Turma: BM171

Alunos: Daniel Coelho, Maria Kelly, Sabrina Araújo e Stéphanie Diana

 MEMORIAL DE CÁLCULOS
1. Dados obtidos
1.1. Padrão 1 ppm
Padrão TR Área
teobromina 2,611 1,2483
teofilina 3,790 11,7564
cafeína 5,035 1,2205

1.2. Padrão 5 ppm

Padrão TR Área
teobromina 2,620 6,1881
teofilina 3,808 11,9046
cafeína 5,063 6,0462

1.3. Padrão 10 ppm

Padrão TR Área
teobromina 2,623 10,7318
teofilina 3,811 10,4393
cafeína 5,065 10,5155

1.4. Padrão 20 ppm

Padrão TR Área
teobromina 2,617 21,4487
teofilina 3,801 10,6803
cafeína 5,050 20,9833

1.5. Padrão 50 ppm

Padrão TR Área
teobromina 2,618 64,5740
teofilina 3,806 12,5062
cafeína 5,056 63,3433

1.6. Amostra 1
Padrão TR Área
teobromina 2,638 17,0079
teofilina 3,824 10,3621
cafeína 5,078 2,0783

Descrição da amostra e modo de preparo:

Chocolate em pó:
pesar 0,25g em um Becker. Adicionar 5ml da solução A e 25 ml de água Mili-Q solubilizar
o sólido e ferver por aproximadamente 5 minutos , com um vidro de relógio tampar o
becker pra evitar perda de amostra e deixar em repouso em temperatura ambiente. Com
um papel de filtro vai filtrar a solução e transferir para um balão volumétrico. Adicionar
1ml de cada uma das duas soluções carrez , avolumar com água Milli-Q até o traço de
referência , e após agitação deixar no sistema por 5 minutos e filtrar novamente com um
filtro(0.22) uma parte da amostra em dois eppendofs..

1.7. Amostra 2
Padrão TR Área
teobromina 2,629 0,1120
teofilina 3,810 1,5657
cafeína 5,056 6,9758

Descrição da amostra e modo de preparo:

Café solúvel:
pesar 0,10g em um Becker. Adicionar 5ml da solução A e 25 ml de água Mili-Q solubilizar
o sólido e ferver por aproximadamente 5 minutos , com um vidro de relógio tampar o
becker pra evitar perda de amostra e deixar em repouso em temperatura ambiente. Com
um papel de filtro irá filtrar a solução,e diluí-lá 5x e transferir para um balão volumétrico.
Adicionar 1ml de cada uma das duas soluções carrez , avolumar com água Milli-Q até o
traço de referência , e após agitação deixar no sistema por 5 minutos e filtrar novamente
com um filtro(0.22) uma parte da amostra em dois eppendofs..

1.9. Amostra 3
Padrão TR Área
teobromina 3,813 7,2315
teofilina 4,779 0,0925
cafeína 5,062 0,2237

Descrição da amostra e modo de preparo:

Café descafeinado:
pesar 0,10g em um Becker. Adicionar 5ml da solução A e 25 ml de água Mili-Q solubilizar
o sólido e ferver por aproximadamente 5 minutos , com um vidro de relógio tampar o
becker pra evitar perda de amostra e deixar em repouso em temperatura ambiente. Com
um papel de filtro vai filtrar a solução e transferir para um balão volumétrico. Adicionar
1ml de cada uma das duas soluções carrez , avolumar com água Milli-Q até o traço de
referência , e após agitação deixar no sistema por 5 minutos e filtrar novamente com um
filtro(0.22) uma parte da amostra em dois eppendofs..

2. Curva de calibração da cafeína sem padronização interna

 Concentração (mg/L) Área
1 1,2205
5 6,0462
10 10,5155
20 20,9833
50 63,3433
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R 2): 0,9943
Equação da reta: f(x) = 1,2718x – 1,4526
Concentração da cafeína na amostra 1: 2,776 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 6,626 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 1,318 mg/L.

3. Curva de calibração da teobromina sem padronização interna

Concentração (mg/L) Área
1 1,2483
5 6,1881
10 10,7318
20 21,4487
50 64,5740
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R 2): 0,9944
Equação da reta: f(x) = 1,2963x – 1,458
Concentração da cafeína na amostra 1: 2,7293 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 6,5003 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 1,2974 mg/L.
 4. Curva de calibração da cafeína com padronização interna
Concentração (mg/L) Áreaanalito/ÁreaPI
1 0,1039
5 0,5075
10 1,0066
20 1,9614
50 5,0705
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R 2): 0,9998
Equação da reta: f(x) = 0,1013x – 0,0123
Concentração da cafeína na amostra 1: 0,2108 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 0,7027 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 0,02255 mg/L.

5. Curva de calibração da teobromina com padronização interna

 Concentração (mg/L) Áreaanalito/ÁreaPI
1 1,2483
5 6,1881
10 10,7318
20 21,4487
50 64,574
Coeficiente de determinação ou quadrado do coeficiente de correlação (R 2): 0,9944
Equação da reta: f(x) = 1,2963x – 1,458
Concentração da cafeína na amostra 1: 2,58349 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 2: 8,6279 mg/L.
Concentração da cafeína na amostra 3: 0,29017 mg/L.

6. Tarefas
6.1. Listar os equipamentos utilizados (marca e modelo) e as condições de análise.

- UHPLC (cromatografia líquida de ultra eficiência) Ultimate 3000 da Thermo Scientific

operando a 30o C com fase móvel composta por etanol 30% e H20 miliQ

6.2. A partir dos valores das áreas dos padrões, fazer os Gráficos da Curva de Calibração
Sx/Spi x Conc. e Sx x Conc. da Cafeína e Teobromina, considerando a Teofilina como padrão
interno de cada um dos alcalóides purínicos. Calcular os coeficientes angular, linear e R 2.
Envie os cromatogramas e os resultados das áreas dos arquivos originais da ChemStation e
as curvas de Excel para os professores.

6.3. Calcular o teor das metilaxantinas (% p/p) nas amostras analisadas. Apresente todos os
cálculos.
Amostra 1:
- Concentração corrigida de cafeína: 0,2108 (calculado anteriormente)
- Concentração corrigida de teobromina: 17,0079 (fornecido)
- Concentração corrigida de teofilina: 10,3621 (fornecido)
Amostra 2:
- Concentração corrigida de cafeína: 0,7027 (calculado anteriormente)
- Concentração corrigida de teobromina: 0,112 (fornecido)
- Concentração corrigida de teofilina: 1,5657 (fornecido)
Amostra 3:
- Concentração corrigida de cafeína: 0,02255 (calculado anteriormente)
- Concentração corrigida de teobromina: 7,2315 (fornecido)
- Concentração corrigida de teofilina: 0,0925 (fornecido)
Agora, para calcular o teor das metilaxantinas em cada amostra (% p/p), dividiremos a
concentração de cada metilaxantina pela soma das concentrações de todas as
metilaxantinas e multiplicaremos por 100.

Vamos realizar os cálculos para cada amostra:

Amostra 1:
- Cafeína: (0,2108 / (0,2108 + 17,0079 + 10,3621)) * 100 = 1,0019%
- Teobromina: (17,0079 / (0,2108 + 17,0079 + 10,3621)) * 100 = 80,5517%
- Teofilina: (10,3621 / (0,2108 + 17,0079 + 10,3621)) * 100 = 48,4464%
Amostra 2:
- Cafeína: (0,7027 / (0,7027 + 0,112 + 1,5657)) * 100 = 30,6145%
- Teobromina: (0,112 / (0,7027 + 0,112 + 1,5657)) * 100 = 4,8852%
- Teofilina: (1,5657 / (0,7027 + 0,112 + 1,5657)) * 100 = 68,5003%
Amostra 3:
- Cafeína: (0,02255 / (0,02255 + 7,2315 + 0,0925)) * 100 = 0,3065%
- Teobromina: (7,2315 / (0,02255 + 7,2315 + 0,0925)) * 100 = 98,5814%
- Teofilina: (0,0925 / (0,02255 + 7,2315 + 0,0925)) * 100 = 1,1121%

Portanto, os teores das metilaxantinas (% p/p) nas amostras analisadas são:

Amostra 1:
- Cafeína: 1,0019%
- Teobromina: 80,5517%
- Teofilina: 48,4464%
Amostra 2:
- Cafeína: 30,6145%
- Teobromina: 4,8852%
- Teofilina: 68,5003%
Amostra 3:
- Cafeína: 0,3065%
- Teobromina: 98,5814%
- Teofilina: 1,1121%
6.4. Por que a teobromina tem tempo de retenção menor do que a cafeína?
A teobromina possui tempo de retenção menor que a cafeína porque ela interage menos
com a fase estacionaria da coluna do que a cafeína que tem maior interação e
consequentemente maior tempo de retenção.

6.5. Existe teobromina e cafeína em todas as amostras? Justifique.

Sim, pois a planilha gerada no cromatograma após a leitura das amostras indica tempos de
retenção praticamente iguais, porém com áreas diferentes pois a concentração em cada
amostra é variada.

6.6. Comparação dos dados experimentais entre si.

FOLHA DE CÁLCULOS:
Curva de calibração da cafeína sem padronização interna
Dado que a área para a cafeína na Amostra 1 é 2,0783, podemos substituir esse valor na
equação:
Concentração = (Área - interceptação) / inclinação
Concentração = (2,0783 - (-1,45259842254978)) / 1,27176502456685
Concentração = 3,53089842254978 / 1,27176502456685
Concentração ≈ 2,7783 mg/L
Portanto, a concentração estimada de cafeína na Amostra 1 é aproximadamente 2,7783
mg/L.

Dado que a área para a cafeína na Amostra 2 é 6,9758, podemos substituir esse valor na
equação:
Concentração = (Área - interceptação) / inclinação
Concentração = (6,9758 - (-1,45259842254978)) / 1,27176502456685
Concentração = 8,42839842254978 / 1,27176502456685
Concentração ≈ 6,6287 mg/L
Portanto, a concentração estimada de cafeína na Amostra 2 é aproximadamente 6,6287
mg/L.

Dado que a área para a cafeína na Amostra 3 é 0,2237, podemos substituir esse valor na
equação:
Concentração = (Área - interceptação) / inclinação
Concentração = (0,2237 - (-1,45259842254978)) / 1,27176502456685
Concentração = 1,67619844754978 / 1,27176502456685
Concentração ≈ 1,3189 mg/L
Portanto, a concentração estimada de cafeína na Amostra 3 é aproximadamente 1,3189
mg/L.