HPLC: Determinação de

diversos compostos em
bebidas por cromatografia
líquida de elevada eficiência
Relatório Experimental

PL3, Grupo nº 1:
Gabriel Cardoso, nº 52701
Susana Mestre, nº 52680
Daniel Pinto, nº 52737
José Brás, nº 51654
Docente: Vukosava Torres
Bioquímica Experimental I
Licenciatura em Bioquímica
5 de Novembro de 2019
Ano Letivo 2019/2020
 Determinação de diversos compostos em bebidas por cromatografia líquida de elevada eficiência

Conteúdo
1. Resumo ............................................................................................................................. 2
2. Tratamento e discussão de resultados ........................................................................... 2
2.1. Esquema da centrifugação diferencial ........................... Erro! Marcador não definido.
2.2. Construção de uma curva de calibração através do método externo (absoluto- analise
quantitativa) ............................................................................................................................ 2
2.3. Determinação da concentração de cafeína para cada bebida ...................................... 3
3. Conclusão ......................................................................................................................... 6

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 Determinação de diversos compostos em bebidas por cromatografia líquida de elevada eficiência

1. Resumo

Este trabalho teve como objetivo identificar a presença de vários compostos,

cafeína, aspartame e benzoato de sódio, em várias bebidas (café, descafeinado, Coca-
Cola e Red Bull), e a determinação da quantidade de cafeina, em miligramas, por
cromatografia líquida de alta eficiência, High performance liquid chromatography, mais
bem conhecida por HPLC. Primeiro foi calibrado o sistema cromatográfico com soluções
de, 1,2,5,10 e 20 ml, de solução de cafeina (15 mg/25 ml) eluídas em balões de 25 ml.
Estas foram usadas como padrão e determinou-se a área média destas (conforme
demonstrado no gráfico). A seguir mediu-se as das bebidas que se pretende estudar, e
através das soluções de cafeina determinou-se a quantidade de cafeina das bebidas
estudadas. Os resultados obtidos foram: 203 mg para o café, 0,98 mg para o
descafeinado, 8,20 mg para a Coca-Cola e 27 mg para o Red Bull, foram conforme os
valores esperados tendo em conta os que valores padrão foram: 212 mg para o café, 3
mg para o descafeinado, 9 mg para a Coca-Cola e 32 mg para o Red Bull.

2. Tratamento e discussão de resultados

2.1. Construção de uma curva de calibração através do método externo

(absoluto- analise quantitativa)

Com o objetivo de representar a curva de calibração, utilizaram-se os seguintes dados:

Quadro 1- Valores de área do pico e da concentração de cafeina para cada amostra padrão.

Padrão Área do pico [Cafeína] (mg /mL)

1 3,3 0,024
2 6,7 0,048
4 33 0,24

2
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A partir destes valores foi possível traçar a curva de calibração da área em função da
concentração.

Padrões de Cafeína
35

30 y = 137,3x + 0,0541
R² = 1
25

20
Area

15

10

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Concentração

Figura 1- Representação gráfica dos padrões de cafeina.

O padrão 3 não foi considerado ao traçar o gráfico de modo a obtermos uma linearidade total
entra a área em função da concentração, como é comprovado por R2= 1.

2.2. Determinação da concentração de cafeína para cada bebida

Através da reta de calibração conseguimos obter a equação que permite calcular a

concentração de cafeina em cada bebida:
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏 ⇔ 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑜 = 𝑚 [𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎] + 𝑏 ⇔ 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑑𝑜 𝑝𝑖𝑐𝑜 = 137,3 [𝑐𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎] + 0,0541

No caso do Café:
5,64−0,0541
𝑥= = 0,04 mg/mL
137,3

Sabendo-se que se extraiu 1 mL de café e diluíram-se num balão volumétrico no volume

total de 50 mL.

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0,04 mg ______ 1 mL
X mg _________ 50 mL
X = 2,03 mg /mL
2,03 mg ______ 1 mL
Y______100mL
Y= 203 mg

Sendo que a quantidade obtida para comparar é 212 mg / 100 mL, e o valor que se obteve
experimentalmente foi de 203 mg/ 100 mL.
Em relação ao descafeinado
0,08−0,0541
𝑥= = 0,0002 mg/mL
137,3

Sabendo-se que se extraiu 1 mL de descafeinado e diluíu-se num balão volumétrico no

volume total de 50 mL.
0,002 mg ______ 1 mL
X mg _________ 50 mL
X = 0,009 mg /mL
0,009 mg ______ 1 mL
Y______100mL
Y= 0,9 mg

Como o valor teórico é 3 mg/ 100 mL de solução e o que se obteve é 0,9 mg / 100 mL conclui-
se que na realização desta amostra ocorreram erros de manuseamento dos operadores, ou o
descafeinado utilizado teria uma melhor quantidade de cafeina do que o esperado.
No caso da Coca-Cola:
3,66 − 0,0541
𝑥= = 0,026 𝑚𝑔/𝑚𝐿
137,3

Sabendo-se que se extraiu 8 mL de Coca-cola e diluíram-se num balão volumétrico no volume

total de 25 mL:
0,026 mg ____ 8 mL

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X mg ______ 25 mL
X = 0,082 mg/mL
0,082 mg _____ 1 mL
Y mg ______100 mL
Y = 8,2 mg

Sendo que a quantidade obtida para comparar é 9,8 mg / 100 mL e o valor que se obteve
experimentalmente foi de 8,2 mg / 100 mL, o que coincide aproximadamente com o esperado.
No caso do Redbull:
4,57−0,0541
𝑥= 137,3
= 0,033 mg/ mL

Sabendo-se que se extraiu 3 mL de Redbull e diluiu-se num balão volumétrico no volume total
de 25 mL:
0,033 mg ____3 mL
X mg _____ 25 mL
X = 0,274 mg/mL
0,274 mg ____ 1 mL
Y mg ______100 mL
Y = 27,4 mg
Sendo que a quantidade obtida para comparar é 32 mg / 100 mL e o valor que se obteve
experimentalmente foi de 27,4 mg / 100 mL, valor este bastante próximo do esperado.

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Comparação entre o valor de concentração de cafeina

250
obtido e o esperado nas amostras

200

150

100

50

0
Café Descafeinado Coca-Cola Redbull
Esperado Obtido

Figura 2- Comparação entre o valor de concentração de cafeina obtido e o esperado nas amostras.

3. Conclusão

Concluímos através dos cromatogramas obtidos, que todas as bebidas analisadas contém
cafeína, porém em concentrações muito variadas.
Para o café, a Coca-Cola e Redbull os valores obtidos experimentalmente foram próximos das
referências. Para o descafeinado porém, o valor obtido não foi tão próximo. Para o café normal,
a concentração é de 203 mg/ 100 mL, a mais alta concentração que obtivemos, sendo a
concentração de referência de 212 mg/ 100 mL. Para o Redbull 27 mg/ 100 mL, sendo a
referência contida na embalagem de 32 mg/ 100 mL. Para a CocaCola obtivemos 8,2 enquanto
a referência era de 9,8. Já para o descafeinado, obtivemos 0,9 um valor quase 3 vezes menor
de cafeina comparando com a referência de 3.
Podemos concluir então que a atividade foi bem-sucedida, pois conseguimos analisar a cafeína
contida em diversas bebidas, tendo em conta apenas o caso do descafeinado em que o valor
não foi tão próximo do esperado.

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