Universidade Estadual de Maringá

Centro de Ciências Biológicas

Departamento de Bioquímica - DBQ
Bioquímica Experimental – 4965/ Turma 01

EXTRAÇÃO E DOSAGEM DAS CASEÍNAS DO LEITE

Discentes:
Julia Abuhamad de Campos RA:112293
Júlia Martino Caldato RA:112294
Karen Lorraine Oliveira Cruz RA:112285

Docente:
Fausto Fernandes de Castro

Maringá, 14 de Março de 2022

 1. Introdução

1.1. Aminoácidos e proteínas

O aminoácido possui uma composição básica (figura 1), sendo essa um

carbono central (-C𝛼-) ligado a um grupo amino (H 2N+-), um grupo carboxila (-
COOH) , um átomo de hidrogênio (-H) e um grupo R, variável, sendo esse, o
diferenciador de aminoácidos, mudando sua estrutura, tamanho, carga elétrica e
solubilidade em água. Além disso existem 20 aminoácidos padrões, como a glicina,
único aminoácido que não é estereoisômero, alanina, tirosina, lisina, glutamato e
cisteína, também existem infinitos aminoácidos que são formados a partir dos
aminoácidos padrões, por exemplo a cistina, constituída por duas cisteínas
oxidadas.

Figura 1: Estrutura base dos aminoácidos.

Uma proteína é constituída por resíduos de aminoácidos ligados através de

ligações peptídicas. Esses resíduos de aminoácidos são os próprios aminoácidos
após perderem elementos de água quando um se liga ao outro aminoácido. Sendo
assim, o grupo amino de um aminoácido, se liga ao grupo carboxila de outro
aminoácido através de uma ligação covalente, sendo esta chamada de ligação
peptídica (figura 2).

Figura 2: Representação de uma reação da ligação peptídica.

1.2. Caseína a proteína do leite
 O leite tem como função natural fornecer aos mamíferos aminoácidos
essenciais necessários para o desenvolvimento e é composto por diversos
nutrientes como as proteínas, os lipídios, os glicídios, os minerais e as
vitaminas. O leite é composto de água, 87,3%, e sólidos totais, 12,7%, assim
distribuídos: proteínas totais, 3,3% a 3,5%; gordura, 3,5% a 3,8%; lactose,
4,9%; além de minerais, 0,7%, e vitaminas, sendo as proteínas totais
divididas em duas classes 80% caseína e 20% proteínas do soro.
Cerca de 95% das caseínas do leite se apresentam em forma de
micelas (figura 3). As micelas são constituídas internamente por α s1-, αs2-, β-
caseína e nanopartículas de fosfato de cálcio coloidal, enquanto que a κ-
caseína está localizada preferencialmente na superfície da micela e são
pouco solúveis em água e interagem com fosfatos de cálcio, sendo capaz de
sequestrar o fosfato de cálcio e formar minúsculos agrupamentos de íons
circundados por uma camada de proteína (figura 4).

Figura 3: Micela de caseína.

Figura 4: Estrutura quaternária da caseína.

 Diversos fatores podem alterar a estabilidade da micela de caseína, como a
hidrólise enzimática, fatores térmicos e mudança de pH e ainda alterações na
concentração de Ca2+ e etanol. A hidrólise enzimática possui maior destaque por
estar relacionada a precipitação da caseína do leite e é usada na produção de
diversos queijos.

1.3. Precipitação isoelétrica

A caseína apresenta seu ponto isoelétrico em pH 4,6 a 4,7. Quando em pH

mais alcalino ou mais ácido as proteínas encontram-se solúveis pois há maior
quantidade de cargas apenas positivas ou apenas negativas que se repelem e assim
possuem maior interação com o solvente, já em seu ponto isoelétrico há equilíbrio
entre essas cargas gerando então uma carga efetiva nula e pouca repulsão entre as
moléculas, sendo este o momento de baixa solubilidade da proteína pois formam-se
grumos e a proteína precipita. Como exemplo a curva de titulação da glicina ( figura
5) no ponto isoelétrico (pI = 5,97) há estabilidade entre as cargas.

Figura 5: Curva de titulação da glicina.

2. Objetivo

Precipitar e extrair as caseínas do leite por meio da precipitação isoelétrica e

centrifugação, respectivamente. Determinar a quantidade de caseínas e outras
proteínas no leite desnatado.

3. Materiais e métodos
 3.1. Materiais

- Pipeta
- Béquer
- pHmetro
- Tubo de centrífuga
- Centrífuga
- Bastão de vidro
- Tubo de ensaio

3.2. Reagentes:

- Leite desnatado
- Ácido acético 5%
- Reagente de Biureto
- Etanol
- Éter etílico
- NaOH 2M

3.3. Métodos

Foi adicionado 10 mL de leite + 40 mL de água e purificado no pHmetro,

acrescentado ácido acético 5%, gota a gota, até a precipitação da caseína
(aproximadamente no pH 4,6). Água, lipídeos e outras proteínas também precipitam.
Após um repouso de 5 minutos o frasco foi agitado e ressuspendido,
recolheu uma alíquota de 10mL para cada equipe, em um tubo de centrífuga.
Foi adicionado na centrifugação a 3000 rpm por 10 minutos. Realizou a
dosagem de proteínas no sobrenadante (principalmente albumina). Tomou 1 mL do
sobrenadante e 4 mL do reativo de biureto. Esta dosagem foi feita no final,
reservando o sobrenadante. Retirando todo o sobrenadante com cuidado para não
perder o precipitado. Assim, todas as dosagens proteicas foram feitas em conjunto
no final do experimento.
Adicionou-se 2 mL de éter etílico, e em seguida, homogeneizou com um
bastão de vidro.Foi adicionado na centrifugação a 3000 rpm por mais 2 minutos
desprezou o sobrenadante (éter na pia).
Adicionou-se 2mL de etanol absoluto e homogeneizar. Foi centrifugado a
3000 rpm por 2 minutos e desprezado o sobrenadante.
Por fim, adicionou-se 2mL de hidróxido de sódio 2 M e dissolveu o
precipitado, completando com água destilada para um volume final de 5 mL. (2 mL
NaOH + 3 mL água). Portanto 5 mL é o volume no qual as proteínas foram
ressuspendidas.

4. Resultados e discussões
 Após a centrifugação, obteve-se um precipitado branco (figura 7).

Figura 6: Solução antes da Figura 7: Solução após

centrifugação a centrifugação

Após todos os procedimentos, descritos em métodos, obteve-se um tubo de

ensaio denominado tubo C com a caseína do leite, um tubo de ensaio denominado S
com o sobrenadante e um tubo de ensaio denominado B, em que foi feito o branco.

Figura 8: Tubos obtidos após a adição do biureto

Essas soluções foram postas no aparelho espectrofotômetro e obteve-se os

seguintes resultados:

Tabela 01: Resultados obtidos na máquina de espectrofotômetro.

.
 Solução Absorção

Branco 0

Caseína 0,338

Sobrenadante 0,084

4.1. Cálculos para o precipitado (caseína):

[concentração]=Absorção × Fc × Fd
[concentração]=0,338 ×25 ×5
mg
[concentração]=42,25
mL

42,25 mg−1mL
X mg−10 mL
X =422,5 mg

422,5 mg−10 mL
Y mg−200 mL
Y =8450 mg em 200 mL
Y =8,45 g em 200 mL

4.2. Cálculos para o sobrenadante:

[concentração]=Absorção × Fc × Fd
[concentração]=0,084 ×25 ×5
mg
[concentração]=10,5
mL

10,5 mg−1 mL
X mg−10 mL
X =105 mg

105 mg−10 mL
Z mg−200 mL
Z=2100 mg em200 mL
Z=2,10 g em200 mL

4.3. Cálculos para proteínas totais:

proteínastotais =Y + Z
Y + Z=8,45 g+2,10 g
 proteínastotais=10,55 g em 200 mL de leite

O valor de proteínas indicado na caixa do leite é de 6,175 g. Comparando

este, ao valor obtido no experimento, há um desvio percentual de 170,85 %. Isso
ocorreu devido ao fato do éter não ser utilizado para retirar a gordura contida no
leite.
Na mesma prática, feita com outra turma, foi realizado o experimento com
adição do éter, nessa obtiveram resultados descritos na tabela 02.

Tabela 02: Resultados obtidos na máquina de espectrofotômetro, após

adição de éter.
.
Solução Absorção

Branco 0

Caseína 0,182

Sobrenadante 0,111

4.4. Cálculos para o precipitado (caseína):

[concentração]=Absorção × Fc × Fd
[concentração]=0,182× 25× 5
mg
[concentração]=22,75
mL

22,75 mg−1 mL
X mg−10 mL
X =227,5 mg

227,5 mg−10 mL
Y mg−200 mL
Y =4550 mg em 200 mL
Y =4,55 g em200 mL

4.5. Cálculos para o sobrenadante:

[concentração]=Absorção × Fc × Fd
[concentração]=0,111× 25× 5
mg
[concentração]=13,875
mL

13,875 mg−1 mL
X mg−10 mL
 X =138,75 mg

138,75 mg−10 mL
Z mg−200 mL
Z=2775 mg em200 mL
Z=2,775 g em200 mL

4.6. Cálculos para proteínas totais:

proteínastotais =Y + Z
Y + Z=4,55 g+2,775 g
proteínastotais =7,325 g em 200 mLde leite

Nesse segundo experimento, houve uma porcentagem de erro menor,

comparando-se com o primeiro. Essa porcentagem de erro foi de 118 %, sendo
assim, ainda obteve-se mais proteínas no experimento, quando comparado a
indicação da caixa do leite. Isso pode ser explicado pelo uso da curva usada para os
cálculos. Essa não foi efetuada no dia da realização do experimento, causando o
erro na obtenção de proteínas a mais do que indicado na caixa do leite.

5. Conclusão

Assim, após precipitação e extração, podemos obter para nossa amostra de

leite desnatado, onde não foi usado o éter para retirada de gorduras, 10,55 g de
proteínas totais em 200 mL de leite, sendo destes 8,45 g de caseína. Já na amostra
de outra turma utilizando o éter foram encontrados 7,33 g de proteínas totais em 200
mL de leite, sendo destes 4,55 g de caseína. Sabendo que o valor teórico
encontrado na caixa de leite é de 6,175 g encontramos os desvios de 171% e 118%,
respectivamente.

6. Referências bibliográficas

BRASIL, R. B.; NICOLAU, E. S.; CABRAL, J. F.; SILVA, M. A. P. Estrutura e

estabilidade das micelas de caseína do leite bovino. Ciência Animal, Fortaleza, v.
25, n. 2, p. 71-80, 2015.

NELSON, David L.; COX, Michael M. Principios de Bioquímica de Lehninger. [S.

l.: s. n.], 2014.