FUNDAMENTOS DA METODOLOGIA

As proteínas podem ser dosadas em diversos materiais biológicos por várias metodologias. A
reação do "Biureto", que é utilizada para a caracterização de proteínas, pode ser empregada
para a quantificação das mesmas mediante a Colorimetria.

O fundamento da metodologia se baseia no fato de que as proteínas formam um complexo

com o íon cúprico (Cu**) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção a
540 nm. A reação é positiva para peptídios constituídos de no mínimo de três aminoácidos. Tal
complexação também ocorre com o biureto

(H2N-CO-NH-CO-NH2), daí o nome da reação.

MATERIAIS E METÓDOS

- ESPECTROFOTOMETRO (540nm)

- ESTANTE COM 7 TUBOS DE ENSAIO

- PIPETA GRADUADA DE 5 mL

- 2 PIPETAS GRADUAS DE 10 Ml

REAGENTES:

Reagente do Biureto

Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sódio e potássio, dissolvê-los em água

destilada completando o volume a aproximadamente 500 mL. Juntar, sob agitação, 300 mL de
NaOH 10% e completar a 1 litro.

Padrão de Caseína (5mg/mL) – dissolver 2,5 g de caseína em 500 mL de NaOH 0,1 N

PROCEDIMENTO ANALÍTICO

1. Transferir 1 ml de leite (pipeta volumétrica) para tubo de ensaio e completar o

volume com 9 ml de água destilada (esta solução corresponde ao leite diluído

1:10). Agitar bem.

2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro

abaixo.

3. Após a adição do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos. A
coloração púrpura formada é indicativo da presença de proteínas.

4. Fazer leitura de Transmitância a 540 nm em espectrofotômetro e converter em Absorbância

com auxílio de tabela (Ab =2–10log T).
5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, fazer um gráfico em papel milimetrado contendo no
eixo Y os valores de Δ Absorbância ou Δ Leitura no eixo X as concentrações de caseína
expressas em mg/tubo.

6. Interpolar o valor de leitura da amostra de leite diluído e calcular a concentração de caseína

no leite expressando o valor em mg/100 mL de leite.

TUBO ÁGUA CASEÍNA CASEÍNA REATIVO TRANSM ABSORB. Δ

(N°) DESTIL (6mg/mL (mg/tub BIURETO ITÂNCIA 540 nm ABSORB.
) o) (%) 540 nm
0 4 0 0 5 95,94% 0,018 0
1 3.5 0.5 3 5 87,90% 0,056 0,006
2 3 1 6 5 78,34% 0,106
3 2.5 1.5 9 5 71,12% 0,148
4 2 2 12 5 63,82% 0,194
5 1.5 2.5 15 5 59,12% 0,228
6 1 mL leite diluído x 5 27,10% 0,567
(1:10)

RESULTADO E DISCUSSÃO

1. Completar a tabela
2. Gráfico com os valores de absorbância (y) e contração (x)

3. Determinar o valor da concentração de caseína no leite através do gráfico e dar o resultado

em mg/100 mL de Leite

4. Discutir o valor encontrado em relação ao valor nutricional do leite.

O que ocorre com a caseína do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6.5