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Ministrio da Educao

Universidade Tecnolgica Federal do Paran


Campus Sudoeste - Pato Branco
Tecnologia em Controle de Processos
Quimicos

PR

UNIVERSIDADE TECNOLGICA FEDERAL DO PARAN

ANLISES MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS

Mauricio Borges

PATO BRANCO
NOVENBRO 2008

MAURICIO BORGES

ANLISES MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS

Relatrio apresentado disciplina Estgio


Supervisionado como requisito parcial para a
concluso do Curso de Tecnologia em
Controle de Processos Qumicos UTFPR
Campus Pato Branco.

Professora Orientadora: Dr. Solange.

PATO BRANCO,
NOVENBRO 2008.

AGRADECIMENTOS

SUMRIO

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. 4


LISTA DE TABELAS ................................................................................................ 5
1.
INTRODUO ............................................................................................... 6
2.
O ESTGIO SUPERVISIONADO UMA EXIGNCIA CURRICULAR7
2.1. JUSTIFICATIVA.......................................................................................... 7
2.2. OBJETIVOS ................................................................................................. 8
2.3. LOCAL DO ESTGIO SUPERVISIONADO............................................... 9
2.3.1.
Descrio da Empresa............................................................................ 9
2.3.2.
Da Rotina do Laboratrio..................................................................... 11
3.
FUNDAMENTAO TERICA ................................................................ 12
3.1. ASPECTOS HISTRICOS DA MICROBIOLOGIA .................................. 12
3.2. A MICROBIOLOGIA VISANDO SEGURANA ALIMENTAR........... 13
3.3. A IMPORTNCIA DOS MICROORGANISMOS...................................... 14
3.4. MICROORGANISMOS DE INTERESSE EM ALIMENTOS..................... 15
3.4.1.
Bolores ................................................................................................ 15
3.4.2.
Leveduras ............................................................................................ 15
3.4.3.
Bactrias .............................................................................................. 16
3.4.4.
Vrus.................................................................................................... 19
3.5. MICROORGANISMOS INDICADORES................................................... 19
3.5.1.
Coliformes Totais ................................................................................ 19
3.5.2.
Coliformes Fecais e Escherichia coli ................................................... 20
3.5.3.
Enterococos ......................................................................................... 20
3.5.4.
Indicadores gerais de contaminao do alimento .................................. 21
3.5.5.
Bactrias aerbias mesfilas ................................................................ 21
3.5.6.
Bactrias psicrotrficas e termfilas..................................................... 21
3.5.7.
Bactrias anaerbias............................................................................. 21
3.5.8.
Bolores e Leveduras............................................................................. 21
3.5.9.
Estafilococos aureus ............................................................................ 22
3.6. FATORES INTRNSECOS E EXTRNSECOS........................................... 22
3.6.1.
Fatores intrnsecos: .............................................................................. 23
3.6.2.
Fatores Extrnsecos .............................................................................. 28
3.7. CONTAMINAO MICROBIOLGICA DOS ALIMENTOS.................. 30
3.7.1.
Contaminao a partir da gua ............................................................. 30
3.7.2.
Contaminao a partir do solo.............................................................. 31
3.7.3.
Contaminao a partir do ar ................................................................. 31
3.7.4.
Contaminao por material fecal.......................................................... 32
3.7.5.
Contaminao com os microorganismos do prprio alimento............... 32
3.7.6.
Contaminao durante o processamento dos alimentos......................... 33
3.7.7.
Contaminao durante o armazenamento, transporte e comercializao.
34
4.
ANLISES MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS .............................. 35
4.1. DETECO DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS E ESCHERICHIA
COLI 36
4.2. DETECO DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES FECAIS EM
GUA 37

4.3.
4.4.

DETECO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS ....................................... 37


DETECO DE SALMONELLA ................................................................ 38
5.
MATERIAIS E MTODOS ......................................................................... 40
5.1. MATERIAIS ............................................................................................... 40
5.1.1.
Utenslios e vidrarias: .......................................................................... 40
5.1.2.
Meios de cultura e diluentes:................................................................ 40
5.1.3.
Reagentes: ........................................................................................... 41
5.2. MTODOS ................................................................................................. 41
5.2.1.
Contagem de Coliformes totais e fecais em alimentos .......................... 42
5.2.2.
Contagem de Coliformes Totais e Fecais em gua................................ 45
5.2.3.
Contagem de Staphylococcus aureus.................................................... 47
5.2.4.
Contagem de Salmonella...................................................................... 52
6.
CONSIDERAES FINAIS ........................................................................ 61
7.
REFERNCIAS ............................................................................................ 62

LISTA DE FIGURAS

Figura 01: Equipamentos do laboratrio........................................................................ 9


Figura 02: Cmara de fluxo laminar. ........................................................................... 10
Figura 03: Aparelho para homogeneizao.................................................................. 42
Figura 04: Inoculao da amostra................................................................................ 43
Figura 05: Bolhas em tubos de Duhran........................................................................ 44
Figura 06: Adicionando-se o meio na amostra............................................................. 45
Figura 07: Continuao da anlise de coliformes......................................................... 45
Figura 08: Produo coliformes totais. ........................................................................ 46
Figura 09: Contagem de Coliformes fecais e totais...................................................... 47
Figura 10: Inoculao em meio (BP). .......................................................................... 48
Figura 11: Material para realizao do teste................................................................. 49
Figura 12: Produo de bolhas. ................................................................................... 49
Figura 13: Teste de coagulase. .................................................................................... 50
Figura 14: Tubos com material para incubao............................................................ 51
Figura 15: Deteco de Staphylococcus aureus. .......................................................... 52
Figura 16: Contaminao em amostra de frango.......................................................... 53
Figura 17: gar (BS), gar (XLD) e gar (HE)............................................................ 54
Figura 18: Colnias atpicas para Salmonella em (HE)................................................ 54
Figura 19: Colnias tpicas de Salmonella em (BS). .................................................... 55
Figura 20: Colnias atpicas de Salmonella em (XLD). ............................................... 56
Figura 21: Tubos com desenvolvimento de colnias.................................................... 57
Figura 22: Desenvolvimento de colnias. .................................................................... 57
Figura 23: Materiais para realizao do teste............................................................... 58
Figura 24: Deteco de Salmonella. ............................................................................ 59

LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Atividade de gua dos alimentos................................................................ 23
Tabela 02: Atividade de gua dos microorganismos. ................................................... 24
Tabela 03: pH para multiplicao de bactrias............................................................. 25
Tabela 04: Potencial de oxi-reduo dos alimentos...................................................... 26

1. INTRODUO
O presente relatrio descreve as atividades desenvolvidas no laboratrio
LAQUA UTFPR-PR, da Unidade Sudoeste Campus Pato Branco, no que se refere,
especificamente, ao trabalho de Estgio Supervisionado que consistiu em anlises
microbiolgicas de alimentos.
Esse trabalho iniciou em 04 de agosto de 2008 e cujo trmino ocorreu em 15 de
novembro de 2008, com durao total de 400 horas, as quais so exigidas pelo Curso de
Tecnologia em Controle de Processos Qumicos, na disciplina de Estgio
Supervisionado.
De um modo geral, os alimentos so constitudos por carboidratos, protenas,
lipdios, sais minerais, fibras, vitaminas, pigmentos e gua, que so essencialmente
necessrios vida de qualquer organismo vivo, tanto os animais superiores, entre eles o
homem, como os microorganismos unicelulares.
Os microorganismos so responsveis pela deteriorao de alimentos, sendo
responsveis tambm por doenas infecciosas que podem ser transferidas para o
homem, de animais contaminados, ou pela ingesto de alimentos contaminados.
Dentre os aspectos de segurana alimentar, a produo de alimentos seguros tem
sido uma exigncia mundial, especialmente nos ltimos anos, devido a ocorrncias de
toxinfeces na Europa e EUA, mais especificamente em carnes e aves. Com efeito, a
ingesto de alimento seguro o mnimo que o consumidor deseja e espera.
Assim, como trabalho de estgio, no laboratrio LAQUA UTFPR-PR foi
realizado anlises microbiolgicas de alimentos e gua a fim de assegurar a sua
qualidade, determinando, ento, se a quantidade de microorganismos contaminantes
existentes nas amostras estava dentro dos padres exigidos pela legislao.
A primeira parte do relatrio aborda a exigncia legal do Estgio como um dos
requisitos essenciais para a concluso do curso.
Em seguida, a descrio sobre o local do laboratrio em que foi realizado o
estgio.
J, na Fundamentao Terica, abordam-se alguns pressupostos e princpios
necessrios para o controle microbiolgico em alimentos, e guas a partir de estudos
tericos da rea bem como de legislao vigente, que do sustentao e orientao s
atividades desenvolvidas no laboratrio.

2. O ESTGIO SUPERVISIONADO EXIGNCIA CURRICULAR

2.1. JUSTIFICATIVA

O Estgio uma das condies obrigatrias nos cursos de Graduao da


UTFPR, pois visa o aperfeioamento e o desenvolvimento da formao profissional
requisitos essenciais para adentrar ao mercado de trabalho.
Pela integrao Instituio de Ensino/Empresa, as informaes e conhecimentos
tericos obtidos no curso so transferidos para a prtica. A combinao teoria/prtica
oferece ao aluno a ampliao de seus conhecimentos bem como possibilita empresa o
aperfeioamento de seus servios na busca constante da boa qualidade de seus produtos.
O curso de Graduao em Tecnologia tem como finalidade primeira a
preparao do aluno para a sua insero no mercado de trabalho. Com a busca de novos
conhecimentos o acadmico desenvolve aptides e habilidades para acompanhar a
evoluo da tecnologia em sua rea, conforme apontam Deneffe e Vantrappen (2005),
atualmente nenhuma empresa industrial pode se dar ao luxo de ignorar os benefcios
potenciais e os custos de fazer a transio da simples fabricao de produtos para a
fabricao de produtos acrescida de fornecimento de servios. Para fazer essa transio
com sucesso, as indstrias precisam entender as foras que impulsionam a
transformao, as estratgias de prestao de servios existentes e os custos e
oportunidades de fornecer servios com valor agregado.
No Regulamento da Organizao didtico-pedaggica dos Cursos Superiores de
Tecnologia do sistema UTFPR, esto estabelecidas as normas que regulamentam o
estgio supervisionado:
CAPTULO X
Do Estgio Supervisionado:
Art. 34 O aluno dever cumprir o Estgio Supervisionado concomitante ou aps o terceiro perodo.
Art. 35 O estgio curricular supervisionado seguir regras prprias constantes no Regulamento da
Disciplina Estgio Supervisionado dos Cursos Superiores de Graduao do sistema CEFET-PR.

E no Regulamento da disciplina Estgio Supervisionado dos Cursos Superiores


de Graduao, estabelecem-se as finalidades:
CAPTULO I
Do estgio e suas finalidades:
Art. 1 - O Estgio Curricular baseado na lei n 6.494, de 07/12/1977, regulamentado pelo Decreto n
87.497, de 18/08/1982, disposto nos artigos 103 e 104 do Regimento Geral do CEFET-PR e no artigo 36

do captulo XI do Regulamento da Organizao Didtico-Pedaggica do Ensino Superior de Graduao,


obedecer s presentes normas.
Art. 2 - Estgio Supervisionado nos cursos Superiores de Graduao tem por finalidade:
Complementao do ensino e da aprendizagem; Adaptao psicolgica e social do estudante sua futura
atividade profissional; Treinamento do estudante para facilitar sua futura absoro no mercado de
trabalho; orientao do estudante escolha de sua especializao profissional.
Art. 3 - Estgio Supervisionado uma disciplina obrigatria dos Cursos Superiores de Graduao
ministrados pela UTFPR.

Desta maneira, o estgio supervisionado torna-se uma disciplina obrigatria e


importante porque as atividades prticas proporcionam ao estudante uma boa formao
profissional, deixando-o com um conhecimento aprofundado na rea em que realizou o
estgio.

2.2. OBJETIVOS

O objetivo principal do Estgio Supervisionado preparar o aluno para o


mercado de trabalho, pois oferece recursos para isso devido aprendizagem dos
recursos tcnicos e prticos o fazer fazendo no local do estgio, ou seja, na
empresa.
Atravs de tcnicas, dos conhecimentos e das instrues do Supervisor de
Estgio e de colegas de equipe, foi possvel realizar as prticas de laboratrio, de forma
a adquirir experincia, para enfrentar os obstculos que se interpem na prtica do diaa-dia profissional.
O estgio realizou-se no LAQUA (Laboratrio de guas e Alimentos da UTFPR Campus Pato Branco) com objetivo de aprimorar os conhecimentos tericos e
prticos em tcnicas de anlises microbiolgicas de alimentos, bem como o
aprimoramento dos servios oferecidos pelo prprio laboratrio e da complementao
curricular necessria para a concluso do curso e da conseqente obteno do
diploma.

2.3. LOCAL DO ESTGIO SUPERVISIONADO

2.3.1. Descrio da Empresa

O laboratrio LAQUA fica situado na parte anexa ao prdio onde funciona o


curso de Agronomia da UTFPR Campus Pato Branco.
A rea total de 74,31 m2, dividida em dois ambientes, um o laboratrio de
Microbiologia e o outro laboratrio de Fsico-Qumica, cujas paredes so construdas
em alvenaria, e a rea de recepo das amostras revestida de frmica branca e outras
partes so impermeabilizadas com tinta ltex acrlica, o piso de cermica e o forro de
laje.
Na Figura 01, abaixo, esto representados alguns equipamentos que fazem parte
do laboratrio de microbiologia: a bancada, o homogeneizador, a geladeira, e a balana
analtica, e na estante esto os materiais utilizados para realizao das anlises de
alimentos como, os gares e os meios de cultura:

Figura 01: Equipamentos do laboratrio.

Na Figura 02, est representada a Cmara de fluxo laminar muito utilizada no


laboratrio:

Figura 02: Cmara de fluxo laminar.

O laboratrio possui como principais equipamentos: bancadas, para preparao


de material para as anlises, autoclaves, cmera de fluxo laminar, contador de colnias,
diluidores de amostras, estufa de secagem, estufas bacteriolgicas, estufa de
esterilizao, aparelho para banho-maria, geladeira, e outros materiais que compem a
estrutura do laboratrio.
A inaugurao desse laboratrio ocorreu em 03 de dezembro de 1998, atravs de
um convnio entre o CEFET-PR, atual UTFPR Campus Pato Branco e a Prefeitura
Municipal, dando incio primeira compra dos equipamentos para o laboratrio.
Hoje o laboratrio comporta uma grande quantidade de materiais e
equipamentos, e est credenciado pelo Conselho Regional de Qumica da 9 regio, pela
Secretaria do Estado da Agricultura e do Abastecimento (SEAB), e pelo Servio de
Inspeo do Paran referente a Produtos de Origem Animal (SIP/POA).
O atual responsvel tcnico do laboratrio a Professora Simone Beux, que
lidera uma equipe de estagirios (a) do Curso de Tecnologia em Controle de Processos
Qumicos e tambm do Ensino Mdio integrado, Tcnico em Alimentos.
A misso do LAQUA realizar anlises de alimentos e gua, atendendo aos
interesses didticos dos Cursos de Tecnologia em Controle de Processos Qumicos e
Mdio Tcnico melhorando a qualidade dos produtos agro-industriais da regio apartir
de resultados obtidos nas analises que comprovem falhas no processo industrial
exigindo melhoria sistemtica na produo.

Os objetivos principais do laboratrio so:

Fornecer estrutura para que sejam avaliadas a composio e a qualidade da


matria-prima entregue s indstrias de alimentos pelos produtores;

Oferecer s pequenas agroindstrias a oportunidade de analisar e certificar a


qualidade de seus produtos, viabilizando a sua comercializao;

Oferecer aos produtores instrumentos de avaliao e gerenciamento de suas


propriedades para que esses possam melhorar a qualidade do alimento produzido
e sua produtividade;

Conduzir projetos de pesquisa em cincia e tecnologia agroindustrial, com


nfase em especial, ao estudo da qualidade dos alimentos;

Anlises de gua de utilizao no consumo humano e agroindustrial.

2.3.2. Da Rotina do Laboratrio

No perodo do estgio, foram realizadas contnuas anlises de alimentos a fim de


determinar com exatido a ocorrncia de microorganismos indesejveis para o consumo
humano.
O laboratrio oferece estrutura suficiente para realizao de anlises de controle
de qualidade dos alimentos e de guas de consumo e utilizao industrial. As anlises
realizadas foram:

Contagem de coliformes Totais e Fecais;

Contagem de Staphylococcus aureus;

Deteco de Salmonella.
Durante o perodo de estgio vrios alimentos chegaram ao laboratrio, porm

as anlises mais freqentes foram realizadas com amostras de queijos, produtos crneos
e gua.

3. FUNDAMENTAO TERICA

3.1. ASPECTOS HISTRICOS DA MICROBIOLOGIA

Inicialmente, os homens tinham sua alimentao baseada apenas nos abundantes


recursos naturais. Em seguida, o ser humano passou a produzir o prprio alimento, ou
seja, comeou a plantar, criar animais e a processar os alimentos, e, ao lado disso,
comearam, tambm, a surgir doenas transmitidas pelos alimentos e pela deteriorao
devido m conservao dos mesmos.
Segundo Franco (2002), relatos e evidncias histricas indicam que no ano 7000
a.C. o homem j conhecia a fabricao da cerveja e que j eram produzidos a manteiga,
o queijo e o vinho. Tambm j existiam a criao de gado de corte e de leite, alm de
tcnicas de conservao dos alimentos, como a defumao, o uso de neve e do sal.
Os sumrios foram os primeiros a criar gado de corte e de leite e a fabricar a
manteiga, alm de conhecerem tcnicas de conservao de carnes e peixes atravs do
sal. Os egpcios, em 3000 a.C. conheciam o leite, a manteiga e o queijo. A arte de
fabricar vinho iniciou-se com os Assrios em 3500 a.C. Os romanos sabiam como
conservar carnes e frutos do mar com o uso da neve.
J, a compreenso da natureza das doenas causadas por alimentos se deu
atravs de um processo muito lento. A importncia da higiene e limpeza durante a
produo de alimentos demorou a ser reconhecida. As primeiras normas de inspeo de
carnes e abatedouros de animais foram aplicadas somente no sculo XIII.
De acordo com o mesmo autor, em 1658, A. Kircher foi o primeiro a sugerir a
relao entre a decomposio de carnes e de leite e a presena de vermes invisveis a
olho nu.
Em 1765, Spallanzani derrubou a teoria da gerao espontnea, provando que o
caldo de carne cozido e armazenado em recipiente fechado evitava a deteriorao por
um longo tempo.
O francs N. Appert, em 1809, comprovou que a carne pode ser conservada em
recipiente de vidro fechado com gua fervente, por bastante tempo, processo que hoje
conhecido como apertizao.

O processo da pasteurizao ficou conhecido graas ao mdico francs L.


Pasteur, o primeiro cientista a compreender o papel dos microorganismos nos alimentos,
comprovando que o azedamento do leite era causado por microorganismos e que o calor
destrua os microorganismos indesejveis (FRANCO, 2002).

3.2. A MICROBIOLOGIA VISANDO SEGURANA ALIMENTAR

As doenas de origem alimentar ocorrem devido ingesto de alimentos


contaminados por microorganismos ou por toxinas indesejveis. Muitas dessas doenas
no so diagnosticadas como toxinfeco, mas como gripe devido aos sintomas serem
parecidos.
Apenas um pequeno nmero de casos sendo que o nmero real de
toxinfeco muito maior de doenas causadas por alimentos notificado aos
rgos de inspeo de alimento, porque os sintomas so brandos e a vtima no busca
auxlio mdico.
Devido ao nmero crescente e gravidade de doenas transmitidas por
alimentos, tem aumentado o interesse do pblico em relao segurana alimentar. Os
riscos de se adquirir doenas de origem alimentar podem ser reduzidos, atravs da
produo de alimentos seguros, o que requer: controle da fonte; controle do
desenvolvimento e do processo dos produtos; boas prticas higinicas durante a
produo, o processamento, a manipulao, a distribuio, a estocagem, a venda, a
preparao e a utilizao e a abordagem preventiva.
Assim, a analise microbiologia de alimentos, por sua vez, trata tanto dos
organismos patgenos quanto dos degradadores. Visando cobrir a grande variedade de
microorganismos existentes em alimentos, tanto os contaminantes quanto os
deliberadamente inoculados.
Muitos alimentos so degradados por microorganismos, que alm de alterar o
sabor e o odor, tornam-nos desagradveis ao consumo humano. Esse fato de interesse
do consumidor devido qualidade e no segurana alimentar, visto que esses
microorganismos no so patognicos (FORSYTHE, 2002).

3.3. A IMPORTNCIA DOS MICROORGANISMOS

Como os microorganismos podem desempenhar papis muito importantes nos


alimentos, possvel classific-los em trs grupos distintos, dependendo do tipo de
interao existente entre microorganismo e alimento.
O primeiro grupo de microorganismos so os que causam alteraes qumicas
prejudiciais aos alimentos resultando na deteriorao microbiana. deteriorao esta
que altera cor, odor, textura e aspecto do alimento, decorrente da atividade metablica
natural dos microorganismos que, para perpetuar a espcie, utilizam o alimento como
fonte de energia.
O segundo grupo de microorganismos so genericamente denominados
patognicos, que afetam tanto o homem como animais em extremos casos. Chegando
estes ao alimento por inmeras formas: condies precrias de higiene durante a
produo, armazenamento, distribuio ou manuseio em nvel domstico.
O terceiro grupo de microorganismos presentes nos alimentos so os que causam
alteraes benficas modificando as caractersticas originais dos alimentos de forma a
transform-los em um alimento por fim beneficiado. Esses microorganismos so
adicionados intencionalmente aos alimentos para que ocorram reaes qumicas. Nesse
grupo esto todos os microorganismos utilizados na fabricao de alimentos
fermentados como os queijos, vinhos, pes, vegetais e muitos outros (FRANCO, 2002).
No leite so encontrados microorganismos da flora normal no patgenos,
referentes ao terceiro grupo classificado acima, que causam alteraes benficas ao
alimento, por exemplo, as bactrias lcticas, responsveis pela fermentao normal do
leite (acidificao), e so importantes na cura de queijos, na produo de iogurtes e
manteiga.
No entanto, alguns germes, classificado no primeiro grupo de microorganismos,
presentes no leite o tornam inaceitvel ao consumo humano devido fermentao
anormal que provoca a deteriorao do alimento. Outros, classificados como
patognicos referentes ao segundo grupo acima, podem provocar doenas nos
consumidores brucelose, tuberculose, febre aftosa, (ROCHA, 2004).
Segundo

Pelczar

(1981),

os

microorganismos

que

so

empregados

industrialmente para converter a matria-prima em novos produtos so os bolores, as

leveduras e as bactrias. Como esses microorganismos convertem a matria-prima


barata num produto til, so usados em grande escala industrial.
Muitas substncias de elevado valor econmico so produtos do metabolismo
microbiano de significado industrial, como exemplo a produo de antibiticos, de
cervejas e do vinho que dependem da capacidade de leveduras produzirem lcool,
algumas vitaminas, aminocidos e outras substncias qumicas, fabricadas atravs de
seus processos microbiolgicos (PELCZAR, 1981).

3.4. MICROORGANISMOS DE INTERESSE EM ALIMENTOS


3.4.1. Bolores
Os bolores so formados por um conjunto de hifas denominados miclio. Este
tem duas funes distintas: promover a fixao do bolor ao substrato e promover a
reproduo, atravs da produo de esporos. O miclio dos bolores responsvel pelo
aspecto caracterstico das colnias. Estas podem ter aspecto cotonoso, secas, midas,
compactas, aveludadas, gelatinosas, com coloraes variadas, e so identificadas pela
anlise macroscpica.
Os bolores so menos exigentes que outros microorganismos em relao
umidade, pH, temperatura e nutrientes, e, em sua maioria, so aerbios (FRANCO,
2002).

3.4.2. Leveduras

As leveduras so fungos unicelulares que possuem formas esfricas, ovides,


cilndricas ou triangulares, e podem ter semelhanas a hifas de bolores. Podem ser
subdivididas em dois grupos: as leveduras verdadeiras, que possuem esporos
(ascosporos) e leveduras falsas, que no produzem ascosporos ou qualquer outro tipo de
esporo sexuado.
As leveduras, por sua vez, requerem menos umidade que a maioria das bactrias
e mais umidade que a maioria dos fungos. Para seu crescimento, a temperatura ideal
varia entre 25 C e 30 C e o pH deve ser cido. A melhor forma de multiplicao

ocorre quando esto em aerobiose, mas nos tipos fermentadores melhor na


anaerobiose (FRANCO, 2002).

3.4.3. Bactrias

Segundo Franco (2002), poucas bactrias existentes na natureza so importantes


para os alimentos, as quais podem ser agrupadas em sete categorias:

1) Bactrias Gram-negativas, aerbias e microaerbias:


So oxidase positivos, com flagelos polares e motilidade caracterstica. Apenas o
gnero Campylobacter de interesse para os alimentos, cujas espcies importantes so
C. jejuni, C. coli e C. lari, que so patgenos causadores de doenas de origem
alimentar.

2) Bactrias Gram-negativas aerbias estritas:


Os gneros mais importantes deste grupo so: Pseudomonas e Xanthomonas;
Halobacterium e Halococcus; Acetobacter e Gluconobacter; Acinetobacter e
Alcaligenes, Alteromonas, Brucella, Flavobacterium, Moraxella, Psychrobacter e
Shewanella (FRANCO, 2002).

3) Bactrias Gram-negativas anaerbias facultativas:


Nesse grupo esto includas as famlias Enterobacteriaceae e Vibrionaceae, e os
gneros mais importantes para os alimentos so: Citrobacter, Edwardsiella,
Enteobacter, Erwinia, Escherichia, Hafnia, Klebsiella, Pantoea, Proteus, Salmonella,
Serratia, Shigella, Yersinia, Aeromonas, Plesiomonas e Vibrio. Destaca-se os gneros
Escherichia e Salmonella que so os mais importantes para esse trabalho:
A Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes fecais que indicam
contaminao fecal em alimentos. Essa bactria pode causar reaes indesejveis nos
alimentos, alm de serem patognicas para homens e animais. Outras informaes sobre
este microorganismo esto na pgina n 15.
A Salmonella, segundo Franco (2002), gnero Salmonella pertence
famlia Enterobacteriaceae e compreende bacilos Gram-negativos no produtores de

esporos. So anaerbios facultativos, produzem gs a partir de glicose (exceto S. typhi)


e so capazes de utilizar o citrato como nica fonte de carbono.
Para multiplicao da Salmonella o pH timo fica prximo de 7,0, sendo que
valores superiores a 9,0 e inferiores a 4,0 so bactericidas, e concentraes de sal
superiores a 9% no so toleradas. O nitrito inibitrio e seu efeito acentuado pelo pH
cido. A temperatura ideal para a multiplicao 35-37 C, sendo que o valor mnimo
de 5 C e mximo de 47 C, dependem do sorotipo.
As infeces causadas por Salmonella comeam na mucosa do intestino delgado
e do clon. Aps atravessarem a camada epitelial intestinal, proliferam-se na camada na
qual as clulas epiteliais esto ancoradas.
A Salmonella tem a capacidade de produzir toxinas (citotoxinas e enterotoxinas),
alm das enterotoxinas conhecidas h muito tempo. Essas toxinas so responsveis pelo
efeito txico que essas bactrias apresentam quando sofrem lise celular.
Atualmente, Salmonella um dos microorganismos mais freqentemente
envolvidos em casos de surtos de doenas de origem alimentar em diversos pases,
inclusive no Brasil. So amplamente distribudas na natureza, sendo o trato intestinal do
homem e de animais o principal reservatrio natural. Inmeros surtos de toxinfeco
alimentar causados por Salmonella so conhecidos em vrios alimentos, os mais
freqentes so carnes de aves e outros tipos de carnes.
A salmonelose associada a laticnios, quase sempre causada por leite cru ou
inadequadamente pasteurizado e por queijos. Quanto a produtos derivados de ovos, os
surtos mais freqentes ocorrem em saladas base de ovos, sorvetes e sobremesas de
fabricao caseira (FRANCO, 2002).
Os microorganismos so transportados ao organismo humano devido ao
consumo de gua e alimentos contaminados com fezes humanas ou de animais,
causando infeces bacterianas como, gastroenterite causada por Salmonella e a febre
tifide causada por um sorotipo especfico, a Salmonella typhy (PELCZAR, 1997).

4) Cocos Gram-positivos:
So includas, nesse grupo, as bactrias aerbias e anaerbias facultativas da
famlia Micrococcaceae e os cocos pertencentes aos gneros Aerococcus, Enterococcus,
Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus e Vagococcus.

O cocos de maior interesse para esse trabalho o Staphylococcus, pertencente


famlia Micrococcaceae.
Os Staphylococcus so anaerbios facultativos, encontrados em leses de pele e
nas vias areas do homem e podem contaminar facilmente os alimentos (FRANCO,
2002).

5) Bacilos Gram-positivos produtores de esporos:


Os gneros desse grupo so: Bacillus, Clostridium e Desulfotomaculum. Esse
grupo caracterizado pela produo de esporos, os quais armazenam o material
gentico da bactria. Os esporos so resistentes ao calor, a radiaes ionizantes, aos
compostos qumicos, desidratao e ao congelamento. Por isso so importantes em
alimentos. Os gneros mais conhecidos so:
a) Bacillus: so produtores de catalase. As espcies desse gnero podem ser
aerbias ou anaerbias facultativas, e psicrotrficas, mesfilas ou termfilas. O pH para
a multiplicao varia de 2,0 at 8,0 e a tolerncia do sal pode ser de 2% a 25%. So
encontrados no solo, na gua, em material fecal e em diversos alimentos.
b) Clostridium: so, em sua maioria, anaerbios estritos e catalase negativos.
So encontrados no trato intestinal do homem e de animais e nos alimentos. As espcies
patognicas deste grupo so: C. botulinum e C. perfringens.
c) Desulfotomaculum: a espcie importante para os alimentos D. nifricans,
porque reduzem compostos sulfurados, produzindo H2O o que provoca o
enegrecimento dos alimentos enlatados (FRANCO, 2002).

6) Bacilos Gram-positivos no-esporulados:


As bactrias pertencentes a esse grupo de maior destaque so: Brochothrix,
Carnobacterium, Kurthia, Lactobacillus e Listeria. Dentre esses, os mais importantes
esto citados a seguir:
Lactobacillus podem ocorrer isolados ou em cadeias e geralmente so imveis e
catalase negativos. O crescimento facilitado pelo CO2 e tem necessidade de nutrientes
complexos. Fermentam carboidratos produzindo cido ltico e por isso so bastante
teis em alimentos. Normalmente no so patognicos, porm podem causar
deteriorao.

Listeria so microaerfilos capazes de se multiplicar em temperaturas de


refrigerao dos alimentos. A espcie mais importante L. monocytogenes, por ser
patognica (FRANCO, 2002).

3.4.4. Vrus

Os vrus sobrevivem e se multiplicam parasitando uma clula hospedeira viva,


portanto so inativos nos alimentos (FRANCO, 2000).

3.5. MICROORGANISMOS INDICADORES

Os microorganismos indicadores so utilizados na avaliao da qualidade


microbiolgica da gua e de alimentos, devido s dificuldades encontradas na deteco
de microorganismos patognicos (FRANCO, 2002).
Segundo o autor, so grupos ou espcies de microorganismos que, quando
presentes em um alimento, podem fornecer informaes sobre a ocorrncia de
contaminao de origem fecal, sobre a provvel presena de patgenos ou sobre a
deteriorao potencial do alimento, alm de poderem indicar condies sanitrias
inadequadas durante o processamento, produo ou armazenamento.
A Escherichia coli, microorganismo encontrado no contedo intestinal do
homem e animais de sangue quente, um indicador de contaminao de origem fecal
em gua, desde 1892. (FRANCO, 2002).

3.5.1. Coliformes Totais

So bacilos gram-negativos e no formadores de esporos, capazes de fermentar a


lactose com produo de gs, quando incubadas a 35 37 C, por 48 horas. Dentre as
bactrias desse grupo, pertencentes famlia Enterobacteriaceae e aos gneros
Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, apenas a Escherichia coli tem
como hbitat primrio o trato intestinal do homem e animais. Conseqentemente a
presena de coliformes totais nos alimentos no indica necessariamente, contaminao
fecal ou ocorrncia de enteropatgenos (FRANCO, 2002).

3.5.2. Coliformes Fecais e Escherichia coli

As bactrias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que


apresentam capacidade de continuar fermentando lactose com produo de gs, quando
incubadas temperatura de 44-45,5 C. Nessas condies, ao redor de 90% das culturas
de E. coli so positivas, enquanto entre os demais gneros, apenas algumas cepas de
Enterobacter e Klebsiella mantm essa caracterstica (FRANCO, 2002).
Segundo o autor, a pesquisa de coliformes fecais ou de E. coli nos alimentos
fornece, com maior segurana, informaes sobre as condies higinicas do produto e
melhor indicao da eventual presena de enteropatgenos.
Escherichia coli a espcie predominante entre os diversos microorganismos
anaerbios facultativos que fazem parte da flora intestinal de animais de sangue quente.
Esse microorganismo pertence famlia Enterobacteriaceae e entre suas principais
caractersticas destacam-se bacilos Gram-negativos, no esporulados, capazes de
fermentar glicose com produo de cido e gs, embora alguns sejam anaerognicos
(FRANCO, 2002).
Para o mesmo autor, o significado da presena de E. coli em um alimento deve
ser avaliado sob dois ngulos. Inicialmente E. coli, por ser uma enterobactria, uma vez
detectada no alimento, indica que esse alimento tem uma contaminao microbiana de
origem fecal e, portanto, est em condies higinicas insatisfatrias. O outro aspecto a
ser considerado que diversas linhagens de E. coli so comprovadamente patognicas
para o homem e para os animais.

3.5.3. Enterococos

Essas bactrias so atualmente denominadas Enterococcus faecalis e


Enterococcus faecium, que apresentam limitaes de seu uso para indicao de
contaminao fecal, pois alm de serem encontradas em diferentes partes do trato
intestinal, so mais resistentes, visto que, apresentam uma sobrevida maior do que os
enteropatgenos no solo, vegetais e em alimentos. Entretanto, a presena elevada desses
microoganismos, em alimentos, indica prticas sanitrias inadequadas ou exposio do
alimento a condies favorveis para multiplicao dessas bactrias (FRANCO, 2002).

3.5.4. Indicadores gerais de contaminao do alimento

Os microorganismos, quando em nmero elevado, provocam a deteriorao


diminuindo o tempo de prateleira dos alimentos. A contagem dos microorganismos
indicadores informa, geralmente, em que condies o alimento foi preparado
(FRANCO, 2002).

3.5.5. Bactrias aerbias mesfilas

A contagem em placas dessas bactrias empregada para indicar a qualidade


sanitria dos alimentos. O nmero elevado desse microrganismo indica insalubridade do
alimento, devido normalmente matria-prima contaminada ou processamento
insatisfatrio, com exceo dos alimentos fermentados (FRANCO,2002).

3.5.6. Bactrias psicrotrficas e termfilas

A contagem dessas bactrias avalia o grau de deteriorizao de alimentos


refrigerados e daqueles que so submetidos a tratamento trmico (FRANCO,2002).

3.5.7. Bactrias anaerbias

A presena dessas bactrias indica que houve condies favorveis para a


multiplicao de microorganismos patognicos anaerbios, como Clostridium
botulinum e Clostridium perfringens (FRANCO,2002).

3.5.8. Bolores e Leveduras

A presena de fungos em alimentos cidos e de baixa atividade de gua como,


frutas, queijos, alimentos congelados, desidratados e em conserva, quando armazenados
em condies inadequadas provoca deteriorao e grande prejuzo econmico.
Para que a presena desses microorganismos no se torne um perigo sade
pblica devido s micotoxinas que os bolores produzem, necessrio que os

manipuladores tomem alguns cuidados visando a eliminao ou diminuio da


contaminao, como as boas prticas de higiene, armazenamento adequado, reduo do
contato do alimento com o ar, entre outras (FRANCO,2002).

3.5.9. Estafilococos aureus

Segundo Franco (2002), a presena de nmeros elevados de S. aureus uma


indicao de perigo potencial sade pblica devido enterotoxina estafiloccica, ,
bem como sanificao questionvel, principalmente quando o processamento envolve
manipulao do alimento. Essa enterotoxina provoca intoxicao entre 105 e 106
unidades formadoras de colnias de S. aureus por grama do alimento (UFC/g).
As bactrias do gnero Staphylococcus so cocos Gram-positivos. So
anaerbios facultativos, com maior crescimento, sob condies aerbias na qual
produzem catalase. Pertencentes famlia Micrococcaceae, que aparecem como forma
de cacho de uva, ocorrem isolados, aos pares e em aglomerados. Podem multiplicar-se
em 7,5% a 15% de NaCl.
Os S. aureus so bactrias mesfilas, apresentando temperatura de crescimento
na faixa de 7 C a 47,8 C, produtores de enterotoxinas entre 10 C e 46 C, com timo
entre 40 C e 45 C. Os surtos de intoxicao alimentar so provocados por alimentos
que permaneceram neste intervalo de temperatura por tempo varivel, de acordo com o
nvel de inculo e temperatura de incubao. So encontrados em leses de pele e nas
vias areas do homem e podem contaminar facilmente os alimentos. Essa espcie a
que est associada mais freqentemente s doenas estafiloccicas, quer sejam de
origem alimentar ou no (FRANCO, 2002).

3.6. FATORES INTRNSECOS E EXTRNSECOS

Esses fatores controlam o desenvolvimento microbiano nos alimentos, podendo


alterar a capacidade de sobrevivncia ou multiplicao dos microorganismos. Os fatores
intrnsecos esto relacionados com as caractersticas prprias do alimento, enquanto que
os extrnsecos esto relacionados com o ambiente em que o alimento se encontra
(FRANCO, 2002).

3.6.1. Fatores intrnsecos:

1) Atividade de gua (Aa):


Os microorganismos necessitam de gua na forma disponvel, ou seja, gua livre
para seu metabolismo e multiplicao. Essa gua utilizada como solvente, e tambm
em reaes qumicas, ao contrrio da gua ligada a macromolculas por foras fsicas.

A tabela n01 relaciona os valores de Aa de alguns alimentos:


Tabela 01: Atividade de gua dos alimentos.
Aa Alimento
>0,97 Frutas frescas e vegetais
>0,98 Aves e pescado frescos
>0,95 Carnes frescas
0,97 Ovos
0,95 a 0,96 Po
0,91 a 1,00 Queijos (maioria)
0,68 a 0,76 Queijo Parmeso
0,87 a 0,95 Carnes curadas
0,90 a 0,94 Bolo assado
0,66 a 0,84 Nozes
0,75 a 0,80 Gelia
0,82 a 0,94 Gelatina
0,80 a 0,87 Arroz
0,67 a 0,87 Farinha de trigo
0,54 a 0,75 Mel
0,51 a 0,89 Frutas Secas
0,60 a 0,65 Caramelos
0,10 a 0,20 Cereais
0,10 Acar
FONTE: (FRANCO, 2002).

A atividade de gua um parmetro utilizado para medir a disponibilidade de


gua em um alimento. Os valores de Aa podem variar de 0 a 1, sendo que na maioria
dos alimentos frescos superior a 0,95.
Os microorganismos tm um valor mnimo, um valor mximo e um valor timo
de Aa para sua multiplicao, o qual menor do que 1. Portanto, no crescem em gua
pura, que apresenta atividade de gua igual a 1. Em geral, bactrias requerem Aa mais
alta que os fungos (FRANCO, 2002).

A tabela n02, a seguir, apresenta alguns exemplos de atividade aquosa mnima


para o crescimento de certos microorganismos:

Tabela 02: Atividade de gua dos microorganismos.


Aa Organismo
0,96 E. coli, Achromobacter
0,95 Salmonella, Clostridium, Proteus
0,94 Lactobacillus
0,92 Rhizopus, Mucor
0,90 Maioria das bactrias, Saccharomyces
0,88 Maioria das leveduras
0,86 Staphylococcus
0,80 Maioria dos mofos
0,75 Bactrias haloflicas
0,62 Leveduras osmoflicas
FONTE: (GAVA, 1984).

Assim, a variao da atividade aquosa resultar numa variao do ritmo de


crescimento. Os alimentos secos, como o po, so mais propensos a serem alterados
pelos mofos; os xaropes e o mel, por terem uma grande quantidade de acar,
favorecem o crescimento das leveduras (osmoflicas) e os alimentos midos (neutros),
como o leite, carne, pescado e ovos, ordinariamente so alterados por bactrias (GAVA,
1984).

2) Acidez (pH):
O pH neutro mais favorvel para a maioria dos microorganismos, sendo que
alguns deles so favorecidos pelo meio cido (bactrias lticas). Os bolores necessitam
de pH mais baixo para a multiplicao que as leveduras, e estas toleram mais a variao
de pH que as bactrias.
Na tabela n03 esto relacionados os valores de pH favorveis para a
multiplicao de algumas bactrias:

Tabela 03: pH para multiplicao de bactrias.


Organismo
Mnimo timo

Mximo

Acetobacter

4,0

5,4 a 6,3

Clostridium botulinum

4,8 a 5,0

6,0 a 8,0

8,5 a 8,8

Clostridium perfringens

5,0 a 5,5

6,0 a 7,6

8,5

Escherichia coli

4,3 a 4,4

6,0 a 8,0

9,0 a 10,0

Lactobacillus (maioria)

3,0 a 4,4

5,5 a 6,0

7,2 a 8,0

Salmonella

4,5 a 5,0

6,0 a 7,5

8,0 a 9,6

Staphylococcus aureus

4,0 a 4,7

6,0 a 7,0

9,5 a 9,8

FONTE: (FRANCO, 2002).

De acordo com o pH, os alimentos so subdivididos em trs grupos: pH superior


a 4,5, pH entre 4,0 e 4,5 e pH inferior a 4,0. Esta classificao est baseada no pH
mnimo para multiplicao e produo de toxina de Clostridium botulinum (4,5) e pH
mnimo para multiplicao da maioria das bactrias (4,0). Verifica-se, ento, que nos
alimentos muito cidos (pH < 4,0), os microorganismos que se desenvolvem ficam
restritos a bolores e leveduras. Os alimentos, como carnes e os produtos marinhos, so
altamente suscetveis multiplicao de microorganismos devido a valores favorveis
de pH (FRANCO, 2002).

3) Potencial de oxi-reduo (Eh):


O potencial de oxi-reduo definido como a facilidade que o substrato tem de
perder ou ganhar eltrons. Os microorganismos aerbios apresentam um Eh positivo
para multiplicao, no caso de bolores, leveduras oxidativas e muitas bactrias que

causam oxidao nos alimentos. Os microorganismos anaerbios apresentam valores


baixos de Eh, como exemplo as bactrias patognicas e deteriorantes.
Algumas

bactrias

aerbias

multiplicam-se

em

condies

reduzidas,

denominadas microaerfilas, por exemplo lactobacilos e estreptococos.


As bactrias da famlia Enterobacteriaceae so facultativas, pois multiplicam-se
tanto em condies de aerobiose quanto de anaerobiose.
Alguns potenciais de oxi-reduo de diferentes tipos de alimentos so
apresentados na tabela n04, a seguir:

Tabela 04: Potencial de oxi-reduo dos alimentos.


Alimento
Potencial de Oxi-reduo EH (mV)
Leite

+200 a +300

Queijo tipo Cheddar

+300 a -100

Queijo tipo Suo

-50 a -100

Ovos infeteis

+500

Fgado cru, modo

-200

Carne crua, inteira

-60 a -150

Carne crua, moda

+225

Carne moda cozida

+300

Carnes enlatadas

-20 a -150

Gros de trigo

-320 a -360

Tubrculos de batata

-150

Suco de uva

+409

Suco de limo

+383

FONTE: (SILVA, 2000).

Torna-se difcil a determinao do valor de Eh em alimentos, devido tenso do


oxignio que envolve o alimento e a presena de compostos qumicos que agem sobre o
valor de Eh. Os alimentos de origem vegetal so deteriorados por bactrias aerbias e
bolores, pois apresentam valores de Eh entre +300 e +400mV. No caso de pedaos
grandes de carnes, o valor do Eh em torno de 200mV, j na carne moda o valor de
Eh sobe para +200mV. Os queijos apresentam valores de Eh variveis, que dependem
das condies de fabricao e variam de 20 a 200mV (FRANCO, 2002).

4) Composio qumica:
Os microorganismos precisam de nutrientes disponveis para sua multiplicao,
como gua, fonte de energia, fonte de nitrognio, vitaminas e sais minerais. Como fonte
de energia, utilizam acares, lcoois, aminocidos e lipdios. Utilizam como fonte de
nitrognio os aminocidos e outros compostos nitrogenados. As vitaminas so
importantes fatores de crescimento de microorganismos, sendo as mais importantes as
do complexo B, a biotina e o cido pantotnico. Os minerais so indispensveis para o
crescimento microbiano, pois esto envolvidos em reaes enzimticas (FRANCO,
2002).

5) Fatores antimicrobianos naturais:


Algumas substncias presentes no alimento tm capacidade de retardar ou
impedir a multiplicao microbiana, por exemplo, os condimentos, pois contm leos
essenciais que possuem atividade antimicrobiana, tais como eugenol no cravo, alicina
no alho e aldedo cinmico e eugenol na canela.
A clara do ovo apresenta agentes antimicrobianos naturais e pH desfavorvel
multiplicao. J o leite, proveniente do gado bovino, contm inmeras substncias
antimicrobianas naturais que apresentam compostos de ao especfica, as
imunoglobinas, o fator complemento, os macrfagos e os linfcitos, alm da lactoferrina
do leite que tambm tem ao antimicrobiana, essa protena inibe a multiplicao
atravs da retirada de ons ferro do leite. O leite contm tambm outras substncias
como a lisozima e a nisina, produzidas por bactrias lticas que controlam o
desenvolvimento microbiano.
Outros agentes antimicrobianos so encontrados em frutas e vegetais, como o
cido hidroxinmico, que apresentam ao sobre bactrias e alguns fungos. As
estruturas biolgicas so fatores antimicrobianos naturais, pois funciona como barreiras
mecnicas contra a penetrao no microorganismo (FRANCO, 2002).

6) Interaes entre microorganismos:


Os microorganismos ao se multiplicar em um alimento, produzem metablitos
que afetam a sobrevivncia de outros microorganismos, como o exemplo das bactrias

produtoras de cido ltico, que alteram o pH do alimento, deixando-o cido demais para
o desenvolvimento dos demais microorganismos.
O maior interesse na rea de alimentos pelas bactrias lticas, que produzem
uma ou mais bacteriocinas que podem ser protenas simples, componentes lipdicos e
acares. As bacteriocinas so empregadas em alimentos com o objetivo de controlar o
desenvolvimento de microorganismos patognicos e deteriorantes. Podem estimular a
competitividade entre os microorganismos, reduzindo a populao de uma certa
bactria, processo que se chama excluso competitiva.
As bacteriocinas, assim como as bactrias produtoras de bacteriocinas em
alimentos, so conservadoras naturais utilizadas na produo de certos tipos de
alimentos para controlar o desenvolvimento de microorganismos patognicos e
deteriorantes (FRANCO, 2002).

3.6.2. Fatores Extrnsecos

1) Temperatura ambiental:
Segundo Franco (2002), os microorganismos podem se multiplicar entre -35 C
a 90 C, por isso necessria a diviso em grupos:
-

Os

microorganismos

psicrfilos

apresentam

temperatura

de

multiplicao entre 0 C e 20 C, com um timo entre 10 C e 15 C;


-

Os microorganismos psicrotrficos se desenvolvem entre 0 C e 7 C;

Os microorganismos mesfilos multiplicam-se entre 25 C e 40 C,


porm apresentam uma temperatura mnima entre 5 C e 25 C e mxima
entre 40 C e 50 C;

Os microorganismos termfilos se multiplicam entre 45 C e 60 C, com


mnima entre 35 C e 45 C e mxima entre 60 C e 90 C.

Os microorganismos psicrfilos e psicrotrficos multiplicam-se em alimentos


refrigerados como carnes, pescados, ovos, frangos e outros, causando deteriorao.
Os gneros pertencentes a este grupo so Pseudomonas, Alcaligenes,
Flavobacterium, Micrococcus e outros. Os microorganismos mesfilos apresentam
grande importncia nos alimentos sendo na maioria patognicos.

As bactrias termfilas importantes em alimentos pertencem ao gnero Bacillus


e Clostridium, incluindo espcies deterioradoras e patognicas. J os fungos crescem em
faixa de temperatura maior que as bactrias, o que no acontece com as leveduras, as
quais no toleram temperaturas altas (FRANCO, 2002).

2) Umidade relativa do ambiente:


A variao desse fator altera o crescimento microbiano devido ao desequilbrio
entre a atividade de gua do alimento e a umidade relativa do ambiente. Quando o
alimento conservado em ambiente com umidade relativa superior sua atividade de
gua, ocorre absoro de gua e, quando o alimento conservado em umidade relativa
inferior atividade de gua, ocorre liberao de gua. Essas alteraes alteram a
capacidade de multiplicao dos microorganismos (FRANCO, 2002).

3) Composio gasosa do ambiente:


Segundo o que aponta Franco (2002), os tipos de microorganismos encontrados
nos alimentos dependem da composio gasosa do ambiente. A presena de oxignio
favorece os microorganismos aerbios, j na ausncia, predominam os anaerbios. As
alteraes no ambiente em que o alimento se encontra podem provocar a morte ou
multiplicao dos microorganismos.
As atmosferas modificadas so empregadas como recurso tecnolgico para
aumentar a vida til dos alimentos, como as embalagens, contendo diferentes
combinaes de gases: oxignio, nitrognio e gs carbnico so as mais empregadas
industrialmente. As embalagens a vcuo so, tambm, bastante empregadas em especial
para carnes.
O CO2 apresenta fator antimicrobiano que depende da temperatura, pH,
atividade de gua e tipos de condies metablicas dos microorganismos. No caso da
temperatura, quanto mais baixa, mais intenso o fator antimicrobiano.
O conhecimento dos fatores extrnsecos e intrnsecos que agem sobre o alimento
permite determinar a vida de prateleira, estabilidade microbiolgica, assim como a
capacidade de crescimento e a produo de toxinas por microorganismos patognicos. O
conhecimento isolado desses fatores pouco til devido aos efeitos interativos entre
eles (FRANCO, 2002).

3.7. CONTAMINAO MICROBIOLGICA DOS ALIMENTOS

Os microorganismos esto presentes na gua, no ar, no solo, no prprio homem,


e, tambm em plantas e animais dos quais so preparados os diversos alimentos.
Qualquer produto alimentcio, industrializado ou in natura, normalmente est
contaminado por microorganismos, inclusive por patgenicoss. Dependendo do
microorganismo que se instala no alimento, podem ocorrer diferentes alteraes, desde
a alterao do produto, como a perda total das caractersticas organolpticas,
nutricionais ou do valor comercial, at a ocorrncia de doenas de origem alimentar.
Tambm no processo de industrializao ocorrem novas contaminaes da
matria-prima, atravs de equipamentos, dos manipuladores e dos prprios processos
tecnolgicos.
Aps a industrializao, o alimento pode ser contaminado devido s falhas nas
embalagens, erros no transporte e armazenamento. Mesmo se tomando todos os
cuidados desde o produto in natura at o produto estar pronto para a comercializao, o
consumidor tambm pode contaminar o alimento por no tomar os cuidados importantes
quanto higienizao.
De um modo geral, os animais e as plantas alm de possurem sua prpria
microflora, podem-se contaminar atravs de microorganismos do ambiente. Os tecidos
internos de plantas e de animais apresentam pouco ou nenhum microorganismos, pois a
grande maioria deles que se encontra nos alimentos, originam-se de contaminao
externa. Como exemplo, o processo de colheita de produtos alimentcios de origem
vegetal, as operaes de obteno de alimentos de origem animal, como o abate, a
pesca, a ordenha, e durante o processamento desses alimentos (SILVA, 2000).

3.7.1. Contaminao a partir da gua

Alm de sua microbiota natural, a gua possui outros microorganismos


provenientes do solo, dos animais e de guas residuais contaminadas. As guas
superficiais apresentam grande variedade e quantidade de microorganismos, enquanto

que as guas subterrneas apresentam quantidade inferior de carga microbiana em


relao s superficiais, por serem depuradas ao atravessar o solo.
A qualidade microbiolgica da gua tem uma grande influncia na contaminao
dos alimentos, devido a vrias bactrias provenientes do solo ou de materiais fecais do
homem ou de outros animais, que a gua em suspenso possui.
Geralmente ocorre contaminao de origem fecal quando no h tratamento da
gua antes de ser destinada ao consumo humano. J que a gua o principal veculo de
disseminao dos microorganismos de origem fecal, se torna obrigatria pelas normas
oficiais de qualidade bacteriolgica, a investigao sistemtica de microorganismos em
produtos alimentcios.
A gua deve ser de excelente qualidade microbiolgica, devido a sua ampla
utilizao na indstria de alimentos. O conhecimento da microflora da gua muito
importante, principalmente em termos de sade pblica e em termos econmicos
(SILVA, 2000).

3.7.2. Contaminao a partir do solo

Como o solo apresenta grande quantidade de microorganismos, pode ser


considerado um veculo de contaminao de superfcie de plantas e dos animais
produtores de alimentos. H certa interao entre gua e solo, portanto, os
microorganismos que se encontram no solo so praticamente os mesmos encontrados na
gua.
As frutas e as verduras, por exemplo, so produtos alimentcios mais propcios
contaminao de microorganismos encontrados no solo. Por isso, necessria a reduo
da carga microbiana com a higienizao da matria-prima antes do processamento, para
eliminar tambm partculas do solo, poeiras e detritos que podem estar na superfcie do
alimento, logo aps a colheita (SILVA, 2000).

3.7.3. Contaminao a partir do ar

O ar apresenta microorganismos em suspenso, principalmente bactrias e


fungos e raramente leveduras, sendo que a maioria no patognica. Os alimentos mais

suscetveis contaminao por esses microorganismos, so as frutas, as verduras, o leite


e os alimentos elaborados em contato com o ar (SILVA, 2000).
O ar possui sua prpria microflora, alm da contaminao acidental proveniente
de microorganismos que chegam pelo ar junto com partculas de p, terra, aerossol, de
rios, lagos e oceanos, gotculas de gua que se formam quando as pessoas tossem ou
com os esporos dos fungos que crescem nas paredes. Por esse motivo, o ar de uma
indstria de laticnios, por exemplo, apresenta uma grande quantidade de bacterifagos
pertencentes s culturas utilizadas nessa unidade industrial.
Por razes sanitrias e econmicas, a contaminao de alimentos a partir do ar se
torna importante, pois muitos microorganismos patognicos e os deteriorantes podem
chegar ao alimento atravs do ar (SILVA, 2000).

3.7.4. Contaminao por material fecal


O tratamento prvio necessrio, para que ocorra a diminuio da flora
microbiana, em material fecal, que vai ser utilizado na fertilizao de solos para o
cultivo de vegetais comestveis.
Como esse tratamento geralmente no ocorre, aumenta o risco de se adquirir
microorganismos patognicos, os quais podem ser encontrados nas fezes de homem e de
animais. Os alimentos tambm podem ser contaminados a partir de fezes de animais,
por bactrias coliformes, anaerbios, enterococos e outras bactrias intestinais. Portanto,
necessrio que os alimentos e as guas destinados ao consumo humano fiquem longe
de fontes de contaminao (SILVA, 2000).

3.7.5. Contaminao com os microorganismos do prprio alimento


a) Microorganismos superficiais Esses microorganismos se encontram em
grande quantidade em pele dos animais, das frutas, na cobertura dos legumes e na casca
dos ovos, atuando como barreiras naturais para que s clulas microbianas no
consigam atravessar. Durante a preparao das carcaas dos animais domsticos,
abatidos para o consumo humano, o couro atua como potencial fonte de contaminao
das carnes. O leite tambm pode ser contaminado com os microorganismos presentes na
superfcie das mamas, durante o processo de ordenha dos animais produtores.

Durante a colheita das frutas e legumes, pode ocorrer penetrao de


microorganismos no interior dos tecidos, atravs das cascas ou pelculas danificadas,
provocando posteriormente a alterao do produto (SILVA, 2000).
b) Microorganismos do trato intestinal dos animais de aougue As carnes
podem ser contaminadas por microorganismos como, a Salmonella, Escherichia,
Staphylococcus, entre outros, presentes no trato intestinal durante o abate, a eviscerao
e a preparao das carcaas dos animais de aougue.
O contedo gastrointestinal uma das principais fontes de contaminao das
carnes e do pescado. Como a superfcie externa, do trato gastrintestinal e do aparelho
respiratrio, e dos tecidos internos dos animais sadios contm muito pouco ou nenhum
microorganismo vivo, no ocorre contaminao. Porm, a contaminao desses
tecidos pode ocorrer pela migrao dos microorganismos atravs do sistema linftico,
pela corrente sangunea, durante a sangria. A contaminao pode ser ainda favorecida
pelas operaes do abate e preparao das carcaas, como tambm durante a desossa e o
manuseio das carnes especificamente (SILVA, 2000).

3.7.6. Contaminao durante o processamento dos alimentos

Atravs de processos industriais podem ocorrer transformaes na microflora da


matria-prima, devido a modificaes nas caractersticas fsico-qumicas, promovidas
pelas operaes tecnolgicas do produto selecionando. Essas alteraes podem
proporcionar a seleo de algumas espcies microbianas e o domnio de outras.
O ambiente fabril pode-se constituir em uma importante fonte de novas
contaminaes, que ser somada carga bacteriana j existente. Nas indstrias de
alimentos, a gua uma das principais fontes de contaminao, que poder ocorrer na
lavagem, na refrigerao e em outras etapas do processamento. A contaminao pode
ocorrer, tambm, na elaborao dos produtos com o ar, no contato com uma superfcie
suja, nas mquinas e seus respectivos acessrios.
Devido falta de higiene pessoal, que um dos principais vetores de
contaminao dos alimentos, a Salmonella spp e a Escherichia coli tm sido detectadas
com bastante freqncia nas mos dos trabalhadores de indstrias de alimentos.

Para evitar esse tipo de problema, o fabricante deve estar atento s normas de
limpeza e higienizao da indstria, dos equipamentos, e do pessoal a fim de reduzir a
contaminao dos alimentos (SILVA, 2000).

3.7.7. Contaminao

durante

armazenamento,

transporte

comercializao.

Segundo Silva (2000), qualquer variao nas condies de armazenamento e


transporte dos alimentos interfere diretamente na proliferao dos microorganismos
contaminantes. Nas carnes e seus derivados ocorrem vrios problemas referentes
contaminao durante a comercializao, devido ao transporte inadequado e s
temperaturas de refrigerao principalmente, prejudicando a qualidade microbiolgica
das carnes frescas. A falta de embalagens nas carnes expostas leva contaminao
digital, devido ao alimento ser manuseado pelas pessoas.
Assim, a aplicao das boas prticas de fabricao garante a obteno de
alimentos seguros, sob o ponto de vista microbiolgico. medida que se obtm
alimentos seguros aumenta a confiabilidade do consumidor, traduzindo em retorno
financeiro (SILVA, 2000).

4.

ANLISES MICROBIOLGICAS DE ALIMENTOS


Atravs dos resultados obtidos nas anlises microbiolgicas do leite e seus

derivados, por exemplo, possvel adquirir informaes sobre as condies em que o


produto foi mantido. Altas contagens de bactrias no alimento podem indicar uma
contaminao excessiva ou condies de refrigerao e armazenamento inadequadas,
no indicando necessariamente presena de bactrias patognicas (PELCZAR, 1981).
De acordo com Franco (2002), as anlises microbiolgicas de alimentos so
fundamentais para verificar quais e quantos microorganismos esto presentes no
alimento, assim como as condies de processamento e higienizao, os riscos que o
alimento fornece sade do consumidor e se o alimento ter ou no a vida til
pretendida. Atravs dessa anlise, possvel verificar se os padres e especificaes
microbiolgicas, nacionais ou internacionais, esto sendo atendidos adequadamente.
A anlise microbiolgica de um produto alimentcio serve para investigar a
presena ou a ausncia de microorganismos, para quantificar os microorganismos
presentes e para identificar e caracterizar as diferentes espcies microbianas. Os
mtodos de anlises laboratoriais podem ser utilizados em cada uma dessas
determinaes, e so divididos em convencionais e rpidos.
Segundo o autor, os mtodos convencionais recebem essa denominao porque
foram desenvolvidos h muitos anos e desde ento vm sendo empregados como
mtodos oficiais na maioria dos laboratrios brasileiros e tambm em outros pases
(FRANCO, 2002).
necessrio conhecer os procedimentos corretos quanto amostra: coletada,
preparo, acondicionamento, manipulao, procedimentos de anlise microbiolgica,
para que os resultados sejam obtidos com exatido.
A tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP), tambm chamada tcnica dos
tubos mltiplos, outra maneira bastante utilizada pelos laboratrios de microbiologia
de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de microorganismos, como
coliformes totais, coliformes fecais, E. coli e S. aureus (FRANCO, 2002).
A avaliao dos resultados d-se pela utilizao de uma tabela de (NMP) com
intervalo de confiana ao nvel de 95% de probabilidade, para as diversas combinaes
de tubos positivos nas sries de trs ou cinco tubos (SILVA, 1997).

4.1. DETECO DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS E ESCHERICHIA


COLI

Os coliformes so enterobactrias (famlia Enterobacteriacea), esses bacilos


Gran-negativos abrangem vrios gneros bacterianos pertencente ao intestino de
animais de sangue quente e tambm distribudo na natureza e vegetais.
Os gneros mais conhecidos de coliformes totais: Enterobacter sp; Klebsiella sp;
Citrobacter sp; Escherichia sp; que pertencem ao grupo das enterobactrias, utilizam a
lactose a 35 C com formao de gs em meio de cultura Caldo Verde Brilhante Lactose
Bile (CLBVB). Esto presentes nas fezes do homem, animais de sangue quente, na
natureza e em certos vegetais. Indicam contaminao ambiental e possvel presena de
patgenos fecais.
Os coliformes fecais so bactrias que utilizam a lactose a 44,5 C no meio de
cultura com produo de gs. O mais importante microorganismo deste grupo a
Escherichia coli, fazendo parte exclusiva do intestino do homem e de animais de sangue
quente. So indicadores sanitrios por indicarem uma possvel presena de
microorganismos patognicos e tambm devido existncia de sorotipos patognicos de
Escherichia coli. So denominados tambm de coliformes termotolerantes ou
coliformes 45 C, e apresentam risco de toxinfeco (> 105/g) (SILVA, 1995).
A deteco inicia-se com o teste presuntivo, que tem o objetivo de recuperar as
clulas estressadas por tratamentos trmicos, pelo congelamento ou por outro motivo.
Oferece como fonte de carbono apenas a lactose, a qual fermentada pelos coliformes
com produo de cidos e gs, que evidenciado nos tubos de Durhan. O meio ainda
contm o lauril sulfato que inibe consideravelmente a flora acompanhante.
No teste confirmativo para coliformes totais, o meio utilizado, o Caldo Verde
Brilhante Lactose Bile 2% (CLBVB), que contm dois inibidores (bile e Verde
Brilhante) do crescimento da microflora acompanhante, especialmente bactrias Gram
positivas, e a lactose, como o nico carboidrato. Assim a produo de gs nos tubos, nas
condies do teste, indica que houve desenvolvimento de bactrias Gram negativas que
fermentam lactose, caracterstica do grupo coliforme.
Para coliformes fecais a definio mesma de coliformes totais, porm esses
microorganismos so incubados temperatura superiores s normais (44,0-45,5 C) com

meio de cultura seletivo Caldo E.C.. A perceptividade do teste observada na


produo de gs no interior dos tubos de fermentao (tubos de Durhan) (SILVA,
1997).

4.2. DETECO DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES FECAIS EM


GUA

O Colilert utilizado para deteco e confirmao simultnea de Coliformes


Totais e E. coli em gua, atravs do mtodo cromofluorognico IDEXX/USA,
padronizado pelo Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater
(APHA, 1992). Seu princpio se baseia na tecnologia patenteada da IDEXX
Laboratories, Inc., conhecida como DSTTM Tecnologia de Substrato Definido. O
produto possui nutrientes indicadores que desenvolvem colorao e/ou fluorescncia,
quando o meio de cultura metabolizado pelos Coliformes Totais e/ou E. coli. O
reagente deve ser adicionado amostra e incubado por 24 horas a 35 C, sendo capaz de
detectar a presena de at 2 milhes de bactrias heterotrficas por 100 ml.

4.3. DETECO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

A contagem de S. aureus em alimentos tem dois objetivos diferentes, um


relacionado com a sade pblica, para confirmar o envolvimento em surtos de
intoxicao alimentar, e outro relacionado com o controle da qualidade higinicosanitria dos processos de produo de alimentos, servindo como indicador de
contaminao ps-processo ou das condies de sanificao das superfcies destinadas
ao contato com alimentos. O sucesso das anlises depende da seleo de um mtodo
adequado, do nmero de clulas presentes na amostra e do processamento do alimento
(SILVA, 1997).
As principais caractersticas utilizadas no isolamento de S. aureus so as
caractersticas seletivas, como habilidade de crescer na presena de substncias
especficas, entre outras, e as caractersticas diferenciais, como a habilidade para reduzir
o telurito de potssio, produzindo colnias pretas, a habilidade para hidrolisar a gema de
ovo, produzindo halos claros em redor das colnias, a capacidade de utilizar o manitol e

crescer a 42-43 C em condies seletivas, a atividade de coagulase e de termonuclease,


entre outras (SILVA, 1997).
Atualmente, o gar Baird-Parker (BP) tem sido mais utilizado, pois combina
com outras substncias necessrias para compor o meio de cultura. O gar (BP) pode
ser usado para o plaqueamento direto de alimentos processados ou in natura. Assim
como os outros, o (BP) no capaz de suprimir completamente o crescimento de
competidores de S. aureus, outras espcies no patognicas do gnero Staphylococcus,
podem produzir colnias semelhantes, havendo necessidade de submeter s colnias
tpicas a testes adicionais para confirmao definitiva, como a atividade de coagulase,
termonuclease e catalase (SILVA, 1997).

4.4. DETECO DE SALMONELLA

Esse mtodo garante a deteco desse microorganismo mesmo em situaes


extremamente desfavorveis, como em alimentos que contm a microbiota competidora
muito maior que a populao de Salmonella, em alimentos que apresentam nmero
muito pequeno de clulas de Salmonella, e nos alimentos em que as clulas se
encontrem injuriadas devido ao processo de preservao, como o calor, o congelamento,
a secagem, por exemplo. Atravs de quatro etapas segue-se a metodologia que pode ser
aplicada a qualquer alimento (SILVA,1997).
a) No Pr-enriquecimento em Caldo no Seletivo, o objetivo recuperar as
clulas injuriadas, para isso incuba-se a amostra em condies no seletivas, no mnimo
por 18 horas.
b) A etapa de enriquecimento em caldo seletivo tem como objetivo inibir a
multiplicao da microbiota acompanhante e promover a elevao preferencial do
nmero de clulas de Salmonella, incubando-se a amostra em caldo seletivo por 18 a 24
horas. Como a resistncia da Salmonella aos agentes seletivos varia de cepa para cepa,
recomenda-se o uso de dois diferentes meios de enriquecimento, o caldo RappaportVassiliadis (RV) que, tem sido recentemente aprovado pela ISO como alternativa para o
caldo tetrationato, e o caldo Selenito Cistina (SILVA, 1997).
c) O plaqueamento seletivo diferencial tem como objetivo promover o
desenvolvimento preferencial de colnias de Salmonella, com caractersticas tpicas que

as distingam dos competidores, para posterior confirmao sorolgica e bioqumica.


Recomenda-se a utilizao de mais de um tipo de meio de cultura, como o gar
Bismuto Sulfito (BS), gar Entrico de Hectoen (HE) e o gar Xilose Lisina
Desoxicolato (XLD).
d) A confirmao a ltima etapa e tem o objetivo de verificar se as colnias
tpicas obtidas nas placas so realmente de Salmonella, atravs de provas bioqumicas e
sorolgicas. Inicialmente as colnias so submetidas aos testes de descarboxilao da
lisina, fermentao da lactose e/ou sacarose e produo de H2S, no gar Lisina Ferro e
gar Trplice Acar Ferro, que permitem eliminar das etapas subseqentes boa parte
das colnias de no Salmonella (SILVA, 1997).
Segundo o mesmo autor, as culturas caractersticas so submetidas ao teste
sorolgico somtico polivalente, sendo eliminadas das etapas subseqentes todas
aquelas com resultado negativo. Culturas com teste positivo ou duvidoso devem ser
submetidas a testes bioqumicos adicionais, para confirmao definitiva.

5. MATERIAIS E MTODOS
Abaixo esto descritos os materiais e mtodos que foram utilizados para
realizao das anlises microbiolgicas de alimentos no LAQUA.

5.1. MATERIAIS
Os materiais utilizados nas anlises microbiolgicas como, meios de cultura,
diluentes, vidrarias e demais utenslios, so preparados para ficarem limpos, estreis e
isentos de resduos qumicos e orgnicos, que possam ter contato com as amostras de
alimentos no momento da anlise, para que no interfiram no resultado da anlise, o que
pode acontecer se no forem preparados.
5.1.1. Utenslios e vidrarias:
o Tubos de diluio;
o Pipetas graduadas;
o Estufa incubadora regulada 35 C;
o Estufa incubadora regulada 45,5 C;
o Tubos de Durhan;
o Ala de Drigalski;
o Ala Nquel-Cromo;
o Lminas de vidro;
o Cmara de Fluxo Laminar;
o Contador de Colnias;
o Homogeneizadores;

5.1.2. Meios de cultura e diluentes:


o gua salina peptonada (H2Osp);
o gar Entrico Hecktoen (HE);
o gar Bismuto Sulfito (BS);
o gar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD);
o gar Trplice Acar Ferro (TSI);
o gar Lisina Ferro (LIA);

o gar Baird Parker (BP);


o gar Tripticase de Soja (TSA) inclinados;
o Caldo Infuso Crebro Corao (BHI);
o Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST);
o Caldo Verde Brilhante Bile (VB);
o Caldo E.coli (EC);
o Caldo Lactosado;
o Caldo Tetrationato (TT);
o Caldo Selenito Cistina (SC);

5.1.3. Reagentes:
o Perxido de Hidrognio (3%);
o Soluo Salina Fisiolgica;
o Anti soro somtico polivalente (Poli O)

5.2. MTODOS

Antes de iniciar a metodologia da anlise do produto recebido, verificam-se as


condies em que o mesmo chega ao laboratrio. Por exemplo, se a embalagem
apresenta danos que expem o alimento em contato com o ambiente fsico, em que
temperatura esse alimento se encontra, para que possa ser armazenado at que a anlise
se inicie sem prejudic-la.
Para obteno da amostra para anlise, todos os cuidados devem ser tomados
para que a amostra seja representativa para o produto como um todo. Para isso, feita
assepsia, com lcool 70%, dos materiais, das bancadas, das balanas, da embalagem que
contm o produto e, principalmente, do manipulador, que deve tomar cuidado para que
no ocorra contaminao cruzada prejudicando a anlise.
A retirada da unidade analtica deve ocorrer de forma assptica e os utenslios
utilizados, para romper a embalagem e retirar homogeneamente a amostra, devem ser
esterilizados. Para que a amostra retirada para a anlise seja representativo como um
todo do produto, necessrio que se obtenha a unidade analtica (25g) de diferentes
partes do produto.

A forma de recebimento do produto a ser analisado descrita acima se processa da


mesma forma para as demais metodologias citadas em seguida.

5.2.1. Contagem de Coliformes totais e fecais em alimentos

A anlise de alimentos em geral se d pelo mtodo do Nmero Mais Provvel


(NMP), segundo EOAC Association of Official Analytical Chemist.
Obtem-se 25g da amostra de diversos pontos, em seguida, pesa-se em balana
analtica. Fazem-se partes menores dessa poro, para facilitar a homogeneizao da
amostra em 225 mL de gua peptonada. A amostra obtida com auxlio de utenslios
estreis como: o garfo e a faca.
A figura n 03 abaixo representa a amostra antes da homogeneizao:

Figura 03: Aparelho para homogeneizao.

Nos homogeneizadores so deixados os erlenmeyer, que contm 25 g da amostra


mais a gua de diluio, por 20 minutos a 200 rpm para que ocorra a homogeneizao.
A figura n04 abaixo representa o procedimento da anlise inicial para contagem
de coliformes:

Figura 04: Inoculao da amostra.

O teste presuntivo, em que amostra inoculada no meio de cultura LST,


preparado com diluies sucessivas (10-1, 10-2 e 10-3), em que de uma diluio para
outra, transferido 1 mL de gua peptonada, diminuindo a concentrao da amostra.
So pipetados alquotas de 1 mL de cada diluio para uma srie de 3 tubos de ensaio
com caldo LST. A incubao deve ser realizada a 35 C por 24 horas, para que, aps
esse tempo, ocorra crescimento de microorganismos, visualizado pela produo de gs
nos tubos de fermentao (tubos de Durhan).
A figura n05 a seguir representa a formao de bolhas nos tubos de Durhan,
aps o perodo de incubao da amostra:

Figura 05: Bolhas em tubos de Duhran.

A produo de gs nos tubos no perodo de 24 horas indica a positividade da


anlise, que com a anotao desses tubos, faz-se a verificao na tabela de NMP dos
limites aceitveis para coliformes, e continua a anlise passando a amostra para meios
confirmativos. Se no houver produo de gs nesse perodo, prossegue a incubao at
atingir as 48 horas e repete-se a leitura.
No teste confirmativo para coliformes totais, os tubos de LST com produo de
gs so separados para que possa ser transferida para cada tubo, uma alada carregada
de cada cultura para tubos com meio confirmativo (VB). A marcao de cada tubo
(LST) tem um nico correspondente no (VB). A incubao realizada em estufa a 35
C por 24-48 horas. Segue-se com a anotao dos tubos de Durhan que produziram gs
nesse perodo, que so confirmativos para coliformes totais, para que possa ser
determinado o nmero mais provvel por grama na tabela NMP.
Para a contagem de coliformes fecais, pegam-se todos os tubos (LST), com
produo de gs, e transfere-se uma alada bem carregada de cada cultura para tubos de
caldo EC, previamente identificados, ou seja, diluio correspondente. A incubao
realizada em banho-maria a 45,5 C por 24 horas e observa-se a produo de gs nos
tubos de Durhan. Os tubos de EC com produo de gs devem ser anotados, que so
confirmativos para coliformes fecais, e segue-se determinando o nmero mais provvel
por grama de alimento.

Atravs da verificao do nmero mais provvel pela contagem dos tubos que
produziram gs, possvel saber se o alimento est dentro dos padres microbiolgicos
exigidos pelo Cdigo de Vigilncia Sanitria.

5.2.2. Contagem de Coliformes Totais e Fecais em gua

No frasco estril coletada a amostra de 100 mL, e levada ao laboratrio.


A figura n06 abaixo refere-se anlise de coliformes em gua:
Figura 06: Adicionando-se o Colilert na amostra.

A anlise inicia-se com o procedimento normal de assepsia do frasco que


contm a amostra de gua transferindo-se 100mL desta amostra para recipiente
assptico adicionando-se Colilert, meio cromofluoronico, em seguida fecha-se o
frasco e agita-se at a completa diluio.

A anlise continua com a transferncia dessa amostra aps homogeneizao para


os tubos de ensaio. Com a pipeta, medem-se 10mL da soluo e a transfere-se para cada
tubo de ensaio, at a completa transferncia da mesma quantidade em 10 tubos estreis.
Incubam-se os tubos com as referidas amostras em estufa bacteriolgica temperatura
de 35-37 C por 24 horas.
A figura n08 representa o desenvolvimento de coliformes em gua de poo:

Figura 08: Produo coliformes totais.

Os tubos que apresentarem colorao amarela intensa indicam positividade para


coliformes totais. Atravs da contagem dos tubos efetuada a leitura na tabela (NMP),
para obter o resultado em NMP/100 mL de amostra.
Os tubos que apresentarem colorao amarela e fluorescncia em lmina UV
365 nm, consideram-se positivos para coliformes fecais. Atravs da tabela faz-se a
leitura para se obter o resultado em NMP/100 mL.
Na figura n09 representa-se o esquema geral de anlise para contagem de
coliformes totais e fecais pelo mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP):

Figura 09: Contagem de Coliformes fecais e totais.

FONTE: (SILVA, 1997).

5.2.3. Contagem de Staphylococcus aureus

So pesados 25 g da amostra na balana analtica, utilizando-se os utenslios


estreis, garfo e faca, para que se possam obter pedaos pequenos de diversos pontos da
amostra. Nos homogeneizadores so deixados os erlenmeyer, que contm 25 g da
amostra mais a gua de diluio, por 20 minutos a 200 rpm para que ocorra a
homogeneizao.
Para a preparao do meio, calculada a quantidade suficiente de telurito e
gema de ovo para se dissolver completamente em 120 mL de gar Baird- Parker para a

quantidade da amostra acima. A soluo adicionada nas placas de petri,


aproximadamente 30 mL, e atingindo aspecto consistente, no decorrer de alguns
minutos, prossegue-se a anlise identificando as placas com as respectivas
concentraes.
Selecionam-se quatro diluies seriadas da amostra (10-1, 10-2, 10-3 e 10-4), para
inocular 0,1 mL (duas gotas) de cada diluio na superfcie de uma placa de gar BairdParker (BP) e mais 0,3 mL (seis gotas) em cada uma das outras 3 placas, previamente
preparadas e secadas. A continuidade da anlise se d com a inoculao da amostra nas
placas de petri. A figura abaixo n10 representa o procedimento:

Figura 10: Inoculao em meio (BP).

O inculo espalhado nas placas de petri, de maior para as placas de menor


diluio, com auxlio da ala de Drigalski at que todo o excesso de lquido seja
absorvido. Incuba-se em estufa a 35 C por 48 horas, com as placas invertidas, aps a
secagem completa das mesmas.
A contagem das colnias presuntivas realizada com a seleo de placas que
contenham de 25 a 225 colnias, sendo que destas so contadas as colnias tpicas de S.
aureus, que so as colnias pretas, circulares, pequenas (mximo 1,5 mm em dimetro),
lisas, convexas, com bordas perfeitas, massa de clulas esbranquiadas nas bordas,
rodeadas por uma zona opaca e/ou um halo transparente se estendendo para alm da
zona opaca. Eventualmente, colnias atpicas podem apresentar-se cinzentas, sem um
ou ambos os halos tpicos.

Na figura n11, representam-se trs placas nas quais o nmero de colnias


contadas ultrapassarem 25 em cada placa, e os tubos para inoculao das colnias com
gar TSI e LIA para realizao do teste de coagulase:

Figura 11: Material para realizao do teste.

Na confirmao das colnias tpicas, selecionam-se no mnimo cinco colnias


tpicas, para teste de coagulase, e havendo menos do que cinco, tomam-se todas.
Havendo, na placa, colnias suspeitas de mais de um tipo (tpicas e atpicas),
selecionam-se pelo menos cinco de cada tipo, ou um nmero proporcional distribuio
dos diferentes tipos de placas.
Aps esse procedimento, transfere-se cada colnia para um tubo de Caldo
Infuso Crebro Corao (BHI), emulsiona-se bem a massa de clulas com o caldo, para
que se faa a transferncia de uma alada para um tubo que contm gar Tripticase de
Soja (TSA) inclinado. A incubao dos tubos ocorre a 35C por 24 horas.
Na figura n12, representa-se a formao de bolhas devido adio de H2O2:

Figura 12: Produo de bolhas.

O teste de catalase feito adicionando-se 1 mL de perxido de hidrognio


cultura, na rampa dos tubos com TSA, e de imediato observa-se o borbulhamento. Dos
tubos de TSA que borbulharam, pega-se o seu correspondente BHI, para realizao do
teste de coagulase (confirmativo).
A figura n13 abaixo representa o procedimento do teste de coagulase.

Figura 13: Teste de coagulase.

No vidro de Coagulase-plasma-EDTA, acrescentam-se 3 mL de gua salina


(soro fisiolgico) e homogeniza-se bem. Com a ajuda do micropipetador, pegam-se 0,2
mL do meio contaminado BHI e coloca-se em um tubo pequeno, no qual acrescentamse 0,5 mL do Coagulase-plasma-EDTA.
Os tubos ilustrados na figura n14 foram incubados aps o trmino do teste
confirmativo:

Figura 14: Tubos com material para incubao.

Em seguida, encuba-se o tubo em banho-maria a 35 C. Observa-se a cada hora,


por um perodo aproximado de 5 horas, se h formao de cogulo.
Os resultados se do pelo clculo do nmero de UFC/g (Unidades Formadoras
de Colnia por grama do produto), em funo do nmero de colnias tpicas contadas,
diluio inoculada e percentagem de colnias confirmadas. Aps, verifica-se se os
resultados esto dentro dos padres microbiolgicos exigidos pelo Cdigo de Vigilncia
Sanitria.
Na figura n15 representa-se o esquema geral de anlise para deteco de
Staphylococcus aureus em alimentos:

Figura 15: Deteco de Staphylococcus aureus.

FONTE: (SILVA, 1997).

5.2.4. Contagem de Salmonella

A anlise comea com o pr-enriquecimento, em que retirada a unidade


analtica de 25 g da amostra de diferentes pontos do alimento, e a transfere-se para um
frasco homogeneizador esterilizado e tarado. Prossegue-se com a adio de 225 mL de
caldo lactosado e homogeneiza-se a amostra. Incuba-se o frasco com as tampas
afrouxadas a 35 C por 18-24 horas.

Aps a incubao, homogeneiza-se o caldo lentamente e faz-se o enriquecimento


em caldo seletivo. Transfere-se 1,0 mL para 10,0 mL de Caldo Tetrationato (TT) e 1,0
mL para 10,0 mL de Caldo Selenito Cistina (SC). A utilizao desses dois meios
diferentes fundamental nesta etapa, pois a resistncia da Salmonella aos reagentes
seletivos varia de cepa para cepa. Incubamdo-se a 35 C por 24 horas.
A figura n16 representa os tubos aps a incubao:

Figura 16: Contaminao em amostra de frango.

Nessa anlise, houve apenas desenvolvimento de colnias no tubo que


corresponde anlise de frango em Caldo Selenito Cistina, e nos outros tubos que
correspondem a picles, tempero em pasta e cogumelos, no houve desenvolvimento no
Caldo Selenito e nem no Rapappot.
A figura n17, ilustra-se os gares antes da inoculao utilizados no
plaqueamento diferencial:

Figura 17: gar (BS), gar (XLD) e gar (HE).

No plaqueamento diferencial feita a agitao dos tubos de enriquecimento


seletivo em agitador tipo vortex, e estria-se uma alada do TT em placas de gar
Entrico de Hectoen (HE), gar Bismuto Sulfito (BS) e gar Xilose Lisina
Desoxiciolato (XLD). O mesmo procedimento repetido com o caldo SC. Incubam-se
as placas invertidas a 35 C por 24 horas e verifica-se se h desenvolvimento de
colnias tpicas de Salmonella.
A figura n18 representa as colnias fermentadoras da lactose ou sacarose, tanto
no meio (SC) quanto no (RV):

Figura 18: Colnias atpicas para Salmonella em (HE).

No gar Enteric Hektoen (HE) as colnias desenvolvidas so transparentes,


verde-azuladas, com ou sem centro preto. Cepas fortemente produtoras de H2S podem
produzir colnias inteiramente pretas. Colnias de fermentadores de lactose ou sacarose
so de cor salmo e no transparentes.
A figura n19 representa colnias tpicas de Salmonella (pretas com brilho) em
meio selenito:

Figura 19: Colnias tpicas de Salmonella em (BS).

No gar Bismuto Sulfito (BS), as colnias desenvolvidas so marrons ou pretas


com ou sem brilho metlico. O meio em redor das colnias muda gradativamente para
colorao marrom a preta, com o prolongamento do tempo de incubao. As placas so
estocadas na geladeira por pelo menos 5 dias antes da anlise, pois o meio recmformado txico para vrias cepas de Salmonella.
A figura n20 representa colnias atpicas de Salmonella, ou seja, amarelas sem
centro preto, fermentadoras de lactose ou sacarose:

Figura 20: Colnias atpicas de Salmonella em (XLD).

No gar Xilose Lisina Desoxicolato (XLD), as colnias desenvolvidas so


transparentes, de cor rosa escuro, com ou sem centro preto. Cepas fortemente
produtoras de H2S podem produzir colnias com centro preto grande e brilhante, ou
mesmo inteiramente pretas. Cepas de fermentadores de lactose ou sacarose produzem
colnias amarelas com ou sem centro preto. Diversas cepas de Salmonella podem
apresentar colnias transparentes amarelas, atpicas, com ou sem centro preto.
Na etapa da confirmao preliminar das colnias tpicas de Salmonella, faz-se a
remoo de uma poro da massa de clulas com auxlio de uma agulha de inoculao,
do centro da colnia tpica e inocula-se em tubos inclinados de gar Lisina Ferro (LIA)
e gar Trplice Acar Ferro (TSI). A inoculao feita com picadas e estrias na
rampa, com a utilizao da mesma ala para inoculao de ambos os tubos. Aps
incubao dos tubos a 35 C por 24 horas, observa-se se h ocorrncia de reao tpica
de Salmonella.
Os tubos de TSI so inclinados com fundo de no mnimo 2,5 cm e incubados
com a tampa ligeiramente afrouxada, para que se mantenham as condies aerbicas.
Atravs desse cuidado pode-se prevenir o excesso de produo de H2S e reaes cidas
errneas na tampa. Os tubos de LIA so inclinados com fundo de no mnimo 2,5 cm e
incubados com a tampa bem fechada, pois a reao de descarboxilao da lisina ocorre
anaerobicamente. Esses cuidados previnem falsos resultados positivos.
A figura n21 representa os tubos de identificao presuntiva (TSI), com
colnias aps incubao:

Figura 21: Tubos com desenvolvimento de colnias.

Aps a incubao - de colnias produzidas em (SC) - em TSI, verifica-se na


figura n21, que no primeiro tubo houve desenvolvimento de colnias tpicas em (HE),
com fundo amarelo, vermelho na rampa e muito pouco H2S produzido (escurecimento
do gar); no segundo tubo referente ao (BS), h formao de colnias tpicas, porm
verifica-se maior escurecimento do gar do que no primeiro tubo; j no terceiro tubo a
reao atpica em (XLD).
A figura n22, tambm representa os tubos de TSI com colnias aps incubao:

Figura 22: Desenvolvimento de colnias.

A reao, tpica de Salmonella em TSI, ocorre quando a colorao da rampa


alcalina apresenta-se vermelha, e o fundo cido, amarelo, produzindo ou no H2S
(escurecimento do gar). J a reao tpica de Salmonella em LIA, se d com fundo e
rampa alcalinos (prpura, sem alterao da cor do meio), com ou sem a produo de
H2S (escurecimento do meio).
A partir dos tubos de identificao presuntiva, que apresentaram resultados
tpicos para a Salmonella, realizado o procedimento do teste sorolgico de aglutinao
em lmina de vidro (confirmao definitiva).
Na figura n23 segue-se o teste sorolgico:

Figura 23: Materiais para realizao do teste.

Para o teste sorolgico, marcam-se dois quadrados em uma lmina de vidro,


usando um lpis de marcar vidro de material hidrofbico. A partir da cultura de 24 horas
em TSI, transfere-se uma alada para cada um dos quadrados demarcados. Adiciona-se
uma gota de soluo salina fisiolgica estril a cada um dos quadrados e emulsifica-se
bem a cultura. Sobre um dos quadrados adiciona-se uma gota de anti-soro e emulsificase. Segurando a lmina contra um fundo preto bem iluminado, so feitos delicados
movimentos de inclinao e rotao da lmina com a soluo, para homogeneiz-la,
observando se ocorre aglutinao no quadrado com o anti-soro. Compara-se com a
aparncia da emulso no quadrado com salina (controle negativo), para no confundir a
aparncia turva da emulso com reao de aglutinao. O resultado ser positivo

quando houver aglutinao na presena do anti-soro e no houver aglutinao na


emulso com salina.
Na figura n24 representa-se o esquema geral de anlise para deteco de
Salmonella em alimentos:

Figura 24: Deteco de Salmonella.

FONTE: (SILVA, 1997).

Foram essas as atividades realizadas durante o perodo de Estgio


Supervisionado.

6. CONSIDERAES FINAIS
No decorrer das atividades de estgio, cuja durao foi de 400 horas, o objetivo
determinado foi alcanado, dentro do que se esperava para se obter conhecimento e
aperfeioamento na rea de microbiologia do Curso de Controle de Processos Qumicos.
Ao passar por esse perodo de experincia, percebemos que estamos cada vez
mais aptos a enfrentar o mercado de trabalho, que exige profissionais bem qualificados,
principalmente na rea de anlises microbiolgicas. Sabemos que necessrio o
conhecimento e a boa prtica de laboratrio, pois a rea de microbiologia necessita de
cuidados precisos na realizao e na avaliao dos resultados das anlises
microbiolgicas de alimentos, para que no ocorram falsos resultados, os quais atravs
de modificaes para sua melhoria, interferem no custo, no processo de produo, na
qualidade e na confiana do produto.
Ao estagiar percebemos o quanto importante o conhecimento e a busca de
aperfeioamento, para que se faa um trabalho de qualidade na prtica, com resultado
satisfatrio para crescer em busca de mercado de trabalho. Isso tambm importante
para definir a rea de especializao do formado, definindo, assim, o rumo de sua
carreira.
A satisfao em realizar esse estgio tambm se d em poder avaliar a qualidade
dos alimentos que chegam ao laboratrio, para que empresas no ramo alimentcio
possam melhorar e/ou assegurar alimentos de boa qualidade, que no interfiram de
modo malfico na sade do consumidor, na regio sudoeste do Paran, e em outras
regies de abrangncia do laboratrio LAQUA da UTFPR- Campus Pato Branco.

7. REFERNCIAS

DENEFFE, Daniel; VANTRAPPEN, Herman. A nova arma das indstrias.


Disponvel em www.ietec.com.br. Acesso em 25 de maio de 2005.
FORSYTHE, Stephen J., Microbiologia da Segurana Alimentar. Porto Alegre:
Editora: Artmed, 2002.
FRANCO, BDGM; LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. So Paulo:
Atheneu , 2002.
PELCZAR, Michael J.; REID, R.; CHAN, E. C. S. Microbiologia. So Paulo:
McGraw-Hill do Brasil, volume 2, 1981.
PELCZAR Jr, M. J.; CHAN, E. C. S; KRIEG, N.R. Microbiologia: Conceitos e
Aplicaes. 2 ed. So Paulo: McGraw-Hill do Brasil, volume 2, 1997.
ROCHA, Demcrito Produtor de leites e derivados. Fortaleza: Ministrio da Cincia e
Tecnologia, 2004.
SILVA J, EA. Manual de Controle Higinico-Sanitrio em Alimentos. So Paulo:
Livraria Varela, 1995.
SILVA, Joo A. Tpicos da Tecnologia dos Alimentos. So Paulo: Livraria Varela,
2000.
SILVA, N.; JUNQUEIRA, VCA; SILVEIRA, NFA. Manual de Mtodos de Anlises
Microbiolgicas de Alimentos. So Paulo: Livraria Varela, 1997.