Universidade Estadual de Maringá

Centro de Ciências Biológicas

Departamento de Bioquímica - DBQ
Bioquímica Experimental – 4965/ Turma 01

PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS

Discentes:
Julia Abuhamad de Campos RA:112293
Júlia Martino Caldato RA:112294
Karen Lorraine Oliveira Cruz RA:112285

Docente:
Fausto Fernandes de Castro

Maringá, 28 de Fevereiro de 2022

 1. Introdução

1.1. Estrutura da proteína

As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações,

denominadas ligações peptídicas, uma ligação peptídica é a união do grupo amino
(-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido,
através da formação de uma amida. Além disso, os diferentes grupamentos "R"
encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas
propriedades das proteínas individuais. A maioria das proteínas encontradas nos
seres vivos é formada por L-aminoácidos. Os D-aminoácidos aparecem somente em
certos antibióticos peptídicos e em peptídeos componentes da parede de algumas
bactérias. Apesar de muitas proteínas conterem outras substâncias, além dos
aminoácidos, a estrutura tridimensional e muitas das propriedades biológicas das
proteínas são determinadas, em grande parte, pelos tipos de aminoácidos presentes
em sua molécula, a ordem em que eles estão unidos entre si, na formação da
cadeia polipeptídica e, ainda, pela inter-relação espacial de um aminoácido com o
outro. Em soluções aquosas de pH neutro, os aminoácidos podem existir em duas
formas. Uma pequena fração pode encontrar numa forma electricamente neutra, ou
seja, com o grupo amina desprotonado (-NH 2) e o grupo carboxila protonado (-
COOH). A maioria estará, no entanto, numa forma ionizada, em que o grupo amina
se encontra protonado (-NH3+ ) e o ácido carboxílico desprotonado a carboxilato (-
COO-), denominando-se esta forma de zwitteriônica (do alemão zwitter, que
significa "híbrido"). Um zwitterion é uma molécula globalmente neutra em termos de
carga elétrica, mas possui cargas locais devido à presença de grupos ionizados.
O ponto isoelétrico (pI) de uma molécula é o pH ao qual essa molécula é
eletricamente neutra. Este conceito é aplicado particularmente a aminoácidos e
proteínas. O ponto isoelétrico não é o pH em que todos os grupos básicos estão
desprotonados e os ácidos protonados, mas o pH em que a carga líquida da
molécula é igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminoácidos e
proteínas apresentam carga líquida positiva. Em um valor de pH acima do pI, os
aminoácidos e proteínas encontram-se com carga líquida negativa.
As proteínas exercerem uma grande variedade de funções na célula, estas
podem ser divididas em dois grandes grupos:
Dinâmicas - Transporte, defesa, catálise de reações, controle do metabolismo
e contração, por exemplo;
Estruturais - Proteínas como o colágeno e elastina, por exemplo, que
promovem a sustentação estrutural da célula e dos tecidos.
Ao descrever a estrutura de uma proteína é conveniente considerar a sua
complexidade através de suas estruturas:
Estrutura primária - É a sequência de aminoácidos ao longo da cadeia
polipeptídica, específica para cada proteína.
Estrutura secundária - Descreve a formação de estruturas regulares pela
cadeia polipeptídica. Pode ser α-hélice ou folha β. .
 Estrutura terciária - É a forma tridimensional como a proteína se "enrola".
Descreve o dobramento final da cadeia polipeptídica por interação de regiões com
estrutura regular.
Estrutura quaternária - Descreve a associação de duas ou mais cadeias
polipeptídicas de estrutura terciária.

1.2. Desnaturação

As proteínas possuem uma estrutura tridimensional bem definida que está

relacionada com suas propriedades físicas e biológicas. A modificação na estrutura
tridimensional nativa de uma proteína, com a consequente alteração de suas
propriedades é conhecida como desnaturação. A desnaturação envolve alterações
nas estruturas quaternária, terciária e secundária. A estrutura primária não é
afetada.
Existem vários agentes desnaturantes de proteínas, tais como: calor, ácidos,
álcalis, solventes orgânicos, soluções concentradas de uréia e guanidina,
detergentes, sais de metais pesados, etc.
Como consequência da desnaturação proteica podemos observar os seguintes
efeitos: diminuição de solubilidade, perda da atividade biológica, alterações na
viscosidade e coeficiente de sedimentação, etc.
A diminuição da solubilidade pode ser explicada pela exposição de radicais
hidrofóbicos e outros que prejudicam a interação proteína-água e favorecem a
interação proteína-proteína.
A desnaturação é o evento primário e importante. Outros efeitos como floculação ou
coagulação são manifestações visíveis das alterações causadas pelos agentes
desnaturantes.

1.3. Precipitações

1.3.1. Precipitação com desnaturação

Além de serem úteis para caracterizar a presença de proteínas em solução,

também são úteis para se fazer a desproteinização de líquidos biológicos para
análise de componentes não protéicos.
Assim como os glicídios (oses) têm poder redutor, como as gorduras têm
propriedades de saponificar, as proteínas têm também uma característica principal
que é a da precipitação, frente a ácidos fortes, sais de metais pesados e alguns
ácidos chamados “reagentes alcalóides”. São ainda precipitáveis, de um modo
geral, por álcool metílico, e outros solventes.

1.3.2. Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da

força iônica)
 Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da
força iônica (aumento da concentração de íons) do sistema. Assim, quando
adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as
cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas
proteicas, diminuindo a interação entre elas. Consequentemente, temos um
aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o
nome de "salting-in". ‘
Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de grandes
quantidades de sal, temos o efeito contrário. A água, que apresenta um grande
poder de solvatação, passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons
provenientes da dissociação do sal. Porém, a água apresenta maior tendência de
solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água,
ocupadas em sua interação com os íons, deixam a estrutura protéica. Como
consequência, temos maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade
em meio aquoso e, consequentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno
de insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da força
iônica do meio dá-se o nome de "salting-out".
Este é um processo importante para separação de proteínas uma vez que a
concentração de sal necessária para a precipitação é diferente para cada proteína.

1.3.3. Precipitação das proteínas por solventes orgânicos

A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em

água. Isso acontece porque a água apresenta constante dielétrica bastante elevada.
Essa grandeza mede a capacidade de interação do solvente com o soluto, o que
difere para cada solvente.
Por exemplo, numa solução contendo somente água e moléculas proteicas
temos as seguintes interações: interação água-proteína e interação proteína-
proteína. Nesse caso, o primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo
porque a água possui grande capacidade de separação das partículas do soluto
(constante dielétrica elevada). Para os solventes orgânicos, a constante dielétrica é
bem inferior à da água e, assim, a interação proteína-proteína se sobressai e,
consequentemente, a proteína precipita.

1.3.4. Precipitação isoelétrica

A técnica de precipitação é frequentemente utilizada na recuperação de

proteínas de soluções aquosas. Uma das formas de se realizá-la é através do
processo de precipitação isoelétrica, que consiste no ajuste do pH do meio ao valor
em que a proteína tem carga global nula, ou seja, no ponto isoelétrico, pI. Ácidos e
bases minerais são normalmente utilizados para ajustar o pH do meio ao pI e
provocar a precipitação de proteínas. Contudo, para se obter proteínas de alta
pureza e evitar a poluição do meio com resíduos indesejáveis, há a necessidade de
um processo adicional para a neutralização da solução e remoção dos sais gerados.
Além disso, concentrações locais elevadas dos ácidos podem causar a
desnaturação da proteína de interesse.

1.4. Salificação

A salificação refere-se ao efeito em que o aumento da força iônica de uma

solução aumenta a solubilidade de um soluto, como uma proteína. Este efeito tende
a ser observado em forças iônicas mais baixas. A solubilidade da proteína é uma
função complexa da natureza físico-química da proteína, pH, temperatura e
concentração do sal utilizado. Também depende se o sal é cosmotrópico, pelo que o
sal estabilizará a água. A solubilidade das proteínas geralmente aumenta
ligeiramente na presença de sal, referido como "salting in".
A solubilidade de proteínas é reduzida em presença de alguns sais, um efeito
chamado de salting out que é utilizada na técnica com acréscimo de sal, que
compete pelo solvente, diminui a solubilidade da proteína até que ela precipite.
Etapas iniciais de fracionamento em uma purificação utilizam diferenças na
solubilidade de proteínas, que são uma função complexa do pH, temperatura,
concentração de sais e outros fatores.

2. Objetivo

Entender como as proteínas reagem com variados tipos de reagentes,

procurando observar mudanças de cor e de solubilidade, visando entender qual a
interação que ocorre e o porquê, seja pela mudança de pH, mudança de carga ou
de interações moleculares.

3. Materiais e métodos

3.1. Materiais

Tubo de ensaio, pipeta graduada, pipetador,pipeta, béquer.

3.2. Reagentes

Ovoalbumina, sulfato de cobre, acetato de chumbo, tricloroacético 10%,

hidróxido de sódio, álcool etílico, acetona, solução alcalina de caseína 1 %, ácido
clorídrico, azul de bromofenol dissolvido em etanol, cloreto de sódio, sulfato de
amônio, água destilada.

3.3. Métodos

3.3.1. Precipitação por ação do calor

 Em um tubo de ensaio, com auxílio de uma pipeta graduada, foi posto 2 mL
de albumina, o tubo de ensaio foi colocado em banho maria em uma leiteira sobre
um bico de bunsen. O resultado foi observado.

3.3.2. Precipitação por interações com sais de metais pesados

Foram posto 2 mL de solução ovoalbumina (cara de ovo), com auxílio de uma

pipeta graduada em dois tubos de ensaio, denominados Cu e Pb, No tubo
denominado Cu, foi posto 5 gotas de sulfato de cobre e no tubo denominado Pb, foi
posto 5 gotas de acetato de chumbo. Os resultados foram observados. Após isso, foi
adicionado reagente em excesso em ambos os tubos de ensaio, os resultados foram
observados novamente.

3.3.3. Precipitação por interações com reagentes acídicos

Em outro tubo de ensaio foi posto 2 mL de proteína, no tubo, denominado

TCA, foi adicionado duas gotas de tricloroacético. O resultado foi observado. Em
seguida foi adicionado reagente em excesso e novamente o resultado foi observado.
Por fim, foi adicionado hidróxido de sódio para mudança de pH. O resultado foi
observado.

3.3.4. Precipitação por ação de reagentes orgânicos

Em outros dois tubos de ensaio foi adicionado 2 mL de albumina, em cada

tubo. No primeiro tubo, denominado E, foi adicionado álcool etílico e no segundo
tubo, denominado A, foi adicionado acetona. Os resultados foram observados.

3.3.5. Precipitação isoelétrica

Em um tubo de ensaio foi pipetado 5 mL de solução alcalina de caseína. Em

seguida foram adicionadas 5 gotas de azul de bromofenol. Posteriormente, foi
adicionado ácido clorídrico gota a gota, e o tubo foi agitado durante esse processo.
A última etapa foi observada com mais rigor.

3.3.6. Solubilização e precipitação por salificação

3.3.6.1. Solubilização por salificação (salting-in)

Em um béquer 250 mL foi adicionado uma clara de ovo. Em seguida foi

adicionado 200 mL de água destilada, e a solução foi agitada com um bastão de
vidro. Essa solução foi pipetada e em um tubo de ensaio foi adicionado 5 mL da
própria, por fim foi adicionado cloreto de sódio gota a gota até a redissolução.

3.3.6.2. Precipitação por salificação (salting-out)

 Em um tubo de ensaio foi adicionado 2 mL da solução obtida no item anterior
(salting - in), em seguida foi adicionado 2mL de solução sulfato de amônio. Nesse
mesmo tubo foi adicionado mais 4 a 6 mL de água destilada. A solução foi
observada.

4. Resultados e discussões

4.1 Precipitações envolvendo desnaturação

Nas precipitações onde ocorre desnaturação há perda da estrutura nativa e

consequentemente da atividade da proteína, alguns agentes desnaturantes são
calor, ácidos, solventes orgânicos, detergentes, sais de metais pesados e etc.
A precipitação da ovoalbumina por ação do calor gerou um precipitado branco
em forma de coágulo, a proteína desnaturada, esta reação é basicamente a mesma
que ocorre quando fritamos ou cozinhamos um ovo e temos a clara como um sólido
branco. Por conta do aumento de temperatura há grande agitação térmica que
acaba forçando a quebra de ligações e interações como as pontes de hidrogênio,
modificando assim a estrutura da proteína de forma irreversível.
A adição de sulfato de cobre e acetato de chumbo a ovoalbumina gera um
precipitado esbranquiçado com muitas bolhas (figura 1). Aqui os cátions dos metais
pesados neutralizam as cargas geralmente negativas de proteínas em pH maior ou
igual a 7,0. Os precipitados gerados são proteinatos.
Na precipitação com agentes ácidos os ânions do ácido tricloroacético (TCA)
combinam-se com as cargas positivas da ovoalbumina e formam sais insolúveis, que
quando em excesso de TCA e adicionado o hidróxido de sódio há aumento de pH e
o sal se torna solúvel (figura 1).
A precipitação da solução aquosa de ovoalbumina com os solventes
orgânicos etanol e acetona se dá pela constante dielétrica da água ser muito maior
(80 a 20 0C) que a desses solventes sendo que a constante dielétrica do etanol é 24
e da acetona 21. A adição desses solventes aumenta a força de atração entre dois
íons de cargas opostas, predominando então a interação proteína-proteína, essa
agregação leva a precipitação das moléculas.
 Figura 1: Precipitação da ovoalbumina com sulfato de cobre (tubo Cu), acetato de chumbo
(tubo Pb) e tricloroacético (tubo TCA).

4.2 Precipitações sem desnaturação

Pela variação do pH e por alterações da força iônica do meio, as proteínas

também podem ser precipitadas e sem perder sua estrutura nativa, este é o caso da
precipitação isoelétrica e solubilização e precipitação por salificação.
Na precipitação isoelétrica quando adicionamos o ácido clorídrico, gota a gota, em
uma solução de caseína (pH ≃ 8) com indicador azul de bromofenol e agitamos, a solução
passa de azul em pH alcalino e proteína solúvel, para um tom levemente esverdeado em pH
4,6 e por se tratar do seu pH isoelétrico (pI) proteína não possui carga elétrica efetiva e se
torna uma proteína insolúvel, após deixada em repouso esse precipitado se deposita no fundo
do tubo de ensaio. Adicionando mais gotas do ácido a solução passa a ser ácida com cor
amarela e a proteína se torna solúvel novamente (figura 2). Isto se dá pois no pI não
existe carga elétrica efetiva consequentemente não há repulsão eletrostática, assim
as moléculas tendem a se precipitar.
 Figura 2: Solução de caseína esverdeada precipitada e amarela solúvel.

A solubilização e precipitação por salificação é caracterizada pelo aumento da

solubilidade da proteína pela adição de pequenas quantidades de sais gerando uma
fraca interação proteína-proteína (salting in) e precipitação na adição de grandes
quantidades de sais (salting out), pois em grande quantidades os sais retiram a água
de hidratação das proteínas fortalecendo a interação proteína-proteína.
Foi retirada uma alíquota de 5 mL da solução de clara de ovo e água ( figura
3), à essa solução precipitada foi adicionado gotas de NaCl gerando o salting in e
tornando a proteína solúvel (tubo 1).

Figura 3: Clara do ovo e água.

Para o salting out foi retirada do tubo 1 uma nova alíquota de 2 mL e foi
adicionado à 2 mL de (NH4)SO4 (tubo 2) gerando um novo precipitado (figura 4). A
este precipitado foi adicionado 6 mL de água destilada que reestabeleceu a força
iônica anterior e tornou a proteína solúvel novamente (figura 5).
 Figura 4: Proteínas precipitadas.

Figura 5: Proteínas solúveis após adição de H2O.

5. Conclusão

Após concluir e observar cada experimento, pode-se entender mais

claramente as precipitações das proteínas, que podem acontecer pela desnaturação
protéica, causada pelo aumento do calor, por interações com sais, por adição de
reagentes acídicos ou reagentes orgânicos. Também pode haver precipitação sem a
desnaturação, com a mudança do pH, chamada precipitação isoelétrica ou por
salificação, neste caso podendo ser reversíveis ou não.

6. Referências bibliográficas

ATKINS, Peter; JONES, Loreta; Princípios de Química: questionando a vida

moderna e o meio ambiente, Porto Alegre: Bookman, 2001.
NELSON, David L.; COX, Michael M. Principios de Bioquímica de Lehninger. [S.
l.: s. n.], 2014.

SOLOMONS, T.W.G. Fundamentals of Organic Chemistry. 4ª edição. São Paulo,

2002.