Precipitação e Floculação

Profa. Andréa Almeida

E-mail: andreafalm@cbiotec.ufpb.br

Curso: Biotecnologia
 Purificação de biomoléculas
Meio de cultivo Clarificação
com células (separação cel/meio)

Células ou M.O. Sobrenadante

(produtos intracelulares) (produtos extracelulares)

Rompimento de células ou Sobrenadante

M.O. (produtos extracelulares)

Remoção dos fragmentos

Separação/concentração
de células ou M.O.
de moléculas
Fração sólida
Tratamentos
Purificação finais
Sobrenadante
 Operações unitárias
Filtração convencional - tamanho de partículas

Centrifugação –Tamanho e densidade das partículas

Clarificação
(separação cel/meio) Filtração tangencial (membranas) – Tamanho de
partículas
Precipitação e Floculação – hidrofobicidade de
partículas
 Precipitação
É a operação na qual uma perturbação, química ou física, em uma
solução causa à formação de partículas insolúveis que podem ser
recuperadas, posteriormente, por separação sólido-líquido.

Considerado um método de
concentração e utilizado
antes da aplicação de
métodos de maior
resolução
 Precipitação
Quais são as vantagens da precipitação???

Principalmente na concentração e purificação de proteínas, ácidos nucleicos e

metabólitos (biomoléculas)

✓ Facilidades de operação adaptadas para grande escala;

✓ Uso em processo contínuo;
✓ Equipamentos simples;
✓ Grande número (oferta) de precipitantes (baixo custo).
 Precipitação
Técnicas de precipitação (reversível) de uma proteína presente em
solução:

✓ A solubilidade da proteína é reduzida por alteração do solvente:

Adição de altas concentrações de sais (sulfato de amônio),
solventes orgânicos (etanol, éter ou acetona), ou polímeros não-
iônicos (polietilenoglicol – PEG).

✓ Diminuição na solubilidade por alterações na própria proteína:

Mudança de carga em virtude da adição de ácidos, bases,

precipitantes catiônicos ou aniônicos, no qual a adição em
baixas concentrações é efetiva
 Precipitação
Solubilidade de proteínas

A solubilidade de uma proteína é muito variável e depende da distribuição

e da proporção dos grupos polares (hidrofílicos) e dos apolares
(hidrofóbicos) na molécula.
 Precipitação
Princípios da solubilidade

Solubilidade Resultado global das interações atrativas e repulsivas

entre as moléculas do solvente e do soluto.

SOLUTO SOLUTO
(Repulsiva)

SOLUTO SOLVENTE
(Atrativa)
 Precipitação
Princípios da solubilidade

As interações entre as moléculas de soluto e solvente, geralmente, são ligações não

covalentes, não há compartilhamento de elétrons e podem ser agrupadas em dois
tipos:

Interações eletrostáticas Interações dipolo -dipolo

Forças de Van der Waals Interações de polarização

induzida
 Precipitação
Princípios da solubilidade

As interações eletrostáticas são a base da solubilidade que moléculas polares neutras

e com cargas apresentam em solventes polares

➢ Moléculas polares neutras:

São resultantes de um dipolo permanente

devido à distribuição assimétrica de elétrons
na sua estrutura (momento dipolar)

➢ Moléculas com cargas:

São as que possuem grupos ionizáveis localizados

em diferentes posições da molécula (íons
dipolares)
 Precipitação
A precipitação deve permitir que a conformação adequada da proteína seja
recuperada, para que esta possa “exercer” sua função bioquímica após o
processo.

❑ Precipitação por sais:

Neutralização das cargas superficiais com redução da camada de hidratação,
favorecendo a agregação dos resíduos hidrofóbicos.

As interações de solvatação se
originam quando as moléculas do
soluto interagem com as moléculas
do solvente criando uma estrutura
ordenada de moléculas de solvente
em torno do soluto.
 Precipitação
❑ Precipitação por sais:

Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento

da força iônica do sistema.

Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução

contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a
interagir com as moléculas proteicas, diminuindo a interação entre elas.

Salting-in"
Solubilidade da proteina
em meio aquoso

Proteina Proteina

Solubilidade da proteina
em meio aquoso Salting-out"
 Precipitação
❑ Precipitação por solventes orgânicos:

A solubilidade de proteínas em solventes varia de acordo com as

distribuições dos resíduos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da
molécula.

Mecanismo:

O principal efeito da precipitação

por solventes é a redução da
atividade de água pela diminuição
da constante dielétrica do meio.
 Precipitação
❑ Precipitação por solventes orgânicos:

As consequências da redução da constante dielétrica podem ser descritas

da seguinte forma:

✓ Imobilização parcial das moléculas de água pela hidratação do grupo

polar (hidroxila) do solvente orgânico, com simultâneo deslocamento
das moléculas de água das zonas hidrofílicas

✓ Maior disponibilidade de cargas superficiais da proteína para

interações eletrostáticas com outras moléculas de proteínas.

Metanol;
Tipos de solventes Etanol;
Acetona.
 Precipitação
❑ Precipitação por polímeros:

Polietilenoglicol (PEG) e polieletrólitos

Mecanismo:

É entendido como exclusão da proteína do meio aquoso.

As precipitações conduzidas em baixas concentrações de PEG, por exemplo, em geral
de 15 a 30% m/v.
As soluções não são muito viscosas e muitas proteínas precipitam

Os polieletrólitos são polímeros iônicos solúveis em água que tem sido utilizados devido
ao seu baixo custo e à redução de resíduos, uma vez que a precipitação ocorre em
baixas concentrações: 0,05 a 0,1% m/v.
 Precipitação
❑ Precipitação por temperatura:

Temperaturas próximas ou pouco inferiores à ambiente favorecem a

manutenção da proteína em solução.

O aumento da temperatura induz interações hidrofóbicas e aumenta a interferência das

moléculas de água nas ligações de hidrogênio, resultando a desnaturação da proteína.

TEMPERATURA Redução na solubilidade de

proteína e sais;

Formam agregados de
TEMPERATURA
proteínas por desnaturação ;
 Precipitação
❑ Precipitação isoelétrica:

Resulta da atração eletrostática das proteínas quando estas se encontram

próximas do ponto isoelétrico (pI)
Método mais simples de precipitar e purificar proteínas.

Princípio do método
Negativa – ocorre repulsão
pH eletrostática e aumenta interação
com o meio
pI
Positiva – ocorre repulsão entre as
moléculas
 Precipitação
❑ Precipitação por afinidade:

Interação específica e seletiva de uma proteína com um ligante,

geralmente, um substrato ou um inibidor se a proteína é uma enzima, que
pode estar ligado a uma matriz insolúvel ou livre em solução.

Princípio do método

A precipitação por afinidade envolve a ligação da proteína a um ligante que co-precipita

com a proteína.

Diminuição da solubilidade de um polímero

Ligação cruzada de proteínas com que possui um ligante de afinidade,
ligantes, corantes, com formação reversivelmente solúvel-insolúvel, por
de um retículo tridimensional variações no pH, T, força iônica...
 Precipitação
Principais métodos de precipitação de proteínas
Precipitante Princípio
Sais neutros Interações hidrofóbicas pela
(salting out) redução da camada de hidratação
Polímeros não-iônicos Exclusão da proteína da fase
aquosa reduzindo a quantidade de
água disponível para solvatação
Calor Interações hidrofóbicas e
interferência das moléculas de
água nas ligações de hidrogênio
Polieletrólitos Ligação com a molécula de
proteína atuando como agente
floculante
Precipitação Neutralização da carga global da
isoelétrica proteína pela alteração de pH do
meio
Solventes orgânicos Redução da constante dielétrica do
meio aumentando as interações
eletrostáticas intermoleculares
Vantagens
- Uso universal
- Baixo custo
- Uso de pequenas
quantidades de precipitante
- Baixo custo
- Simples
- Uso de pequenas
quantidades de precipitante
- Uso de pequenas
quantidades de precipitante
- Facilidade de reciclagem
- Facilidade na remoção
do precipitado
Desvantagens
- Corrosivo
- Liberação de amônia em
pH alcalino
- Aumento da viscosidade
- Risco de desnaturação
- Risco de desnaturação
- Risco de desnaturação
- Risco de desnaturação
- Inflamável e explosivo
 Floculação
Consiste na aglutinação de partículas formadas na coagulação que, por
possuírem ainda dimensões reduzidas e baixas densidades, apresentam
dificuldade de sedimentação
 Floculação
Etapa 1: Coagulação

Pequenas partículas geralmente possuem

cargas de superfície negativas que impedem
a agregação e a estabilização (1a).
Os produtos químicos coagulantes podem ser
adsorvidos às partículas e equilibrar as
cargas. A introdução de cargas opostas
permite que as partículas ligadas formem
flocos estáveis e bem suspensos (1b).
A mistura rápida é necessária para a
adequada dispersão de produtos químicos
coagulantes, para promover colisões de
partículas e a formação de flocos (1c).
 Floculação
Etapa 2: Floculação

A floculação requer a mistura suave e a

utilização de um floculante polimérico de alto
peso molecular.
O floculante adsorve-se aos flocos e facilita a
ligação de lacunas entre os flocos (2a).
Aproximar as partículas cria o alcance eficaz
para as forças de atração Van Der Waals
reduzirem a barreira energética para a
floculação e a forma de flocos fracamente
agregada.
A agregação, ligação e fortalecimento dos
flocos ocorrem até a forma de macroflocos
visivelmente suspensa (2b). Com o peso,
tamanho e força corretos, ocorre a
sedimentação.