Universidade Federal do Amazonas

Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia

Curso - Farmácia
Disciplina - Enzimologia

MÉTODOS DE EXTRAÇÃO E
PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS

Aluizio Gonçalves Brasil Jr.

Abril de 2023
Importância

 Tem impacto no custo das enzimas de interesse

tecnológico.

 O grau de pureza das enzimas comerciais varia

de preparações enzimáticas brutas
(contaminantes) até enzimas altamente
purificadas.
Importância

 A escolha do procedimento de purificação

depende de sua origem.

 Geralmente, as preparações comerciais

consistem em:
 Sobrenadante da fermentação (concentrado),
 Produtos oriundos do lise celular.
 Etapas envolvidas na recuperação da enzima

Obtenção

Células Animais Células Vegetais Microrganismos

Enzimas Enzimas
Intracelulares Extracelulares
Extração Extração

Separação
Recuperação Concentração

Purificação Formulação
1. Etapa de Obtenção

 Enzimas de tecidos (animais/vegetais) requerem

uma etapa de ruptura celular, em geral operação
simples.

 Produção em larga escala em cultivos artificiais?

 Principais enzimas (pancreatina, renina, pepsina,

catalase, papaína, ficina, cardosina, bromelina e
malte).
1. Etapa de Obtenção
Cultura
estoque

Crescimento em
frascos agitados
Preparo “upstream”
Pré-inóculo em
Meio
fermentador

Esterilização

Fermentador
Principal

Separação

Concentação
“downstream”
Purificação

Acabamento
1. Etapas de Recuperação

 Meios de fermentação com misturas complexas.

 Etapas de recuperação e purificação dependem

da localização da enzima de interesse
(intracelular mais difícil).

 Na maioria dos casos – recuperação de enzima

do caldo fermentado ou da massa celular.

 Remoção de material insolúvel, separação,

purificação e polimento.
1.1 Separação
 Emprego de operações unitárias para remoção
de material insolúvel.

 Enzimas extracelulares – caldo resfriado (5°C) e

pH ajustado.

 Fungos filamentosos (centrifugação), bactérias e

leveduras (floculação – Sulfato de alumínio).

 Filtração constitui uma alternativa

(convencional/tangencial/rotativo à vácuo).
1.2 Extração
 Em algumas leveduras (Kluyveromices
marxianus) – enzima na parte externa da
membrana (autólise das células - 50 °C/14horas).

 Enzimas intracelulares – técnicas de lise celular.

Métodos físicos
Métodos químicos
Métodos enzimáticos
Etapas envolvidas na recuperação da
enzima
 Métodos de separação:
 Enzimas extracelulares:
 Filtração
 Centrifugação
 Adsorção
 Enzimas intracelulares e perimembranares:
 Extração prévia
1.2 Extração

 Métodos para rompimento da célula:

 Métodos Físicos:
 Congelamento/descongelamento
 Cisalhamento líquido sob alta pressão
 Moagem com abrasivos
 Sonicação (ultrassom)
1.2 Extração

 Métodos para rompimento da célula:

 Métodos químicos:
 Tratamento com base
 Choque Osmótico
 Tratamento com detergentes (Tween, SDS)
 Tratamento com solventes orgânicos (álcool).
1.2 Extração
 Métodos para rompimento da célula:
Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicas
beta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico
(Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num
pepitídoglicano .
Lisozima  bactérias Glucanases e proteases  leveduras
 1.2 Extração
Extração a partir de Tecidos Animais e Vegetais:

 Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em

leveduras.

 Homogeneização do tecido selecionado em uma solução

tampão adequada é a técnica mais empregada.
Segundo passo: utiliza a centrifugação diferencial para
selecionar a subfração celular apropriada.

 Tecidos vegetais: Forças necessárias elevadas.

 1.3 Concentração

 Solubilidade de uma enzima – distribuição de

cargas.

 Os grupos carregados interagem com íons da

solução – precipitação pode ser induzida (pH,
força iônica, adição de solventes ou polímeros)
 1.3 Concentração
 As técnicas de precipitação são consideradas rápidas e
eficientes – eliminar impurezas similares.

 A solubilidade da proteína é resultado de:

 Interações polares com solventes aquosos.
 Interações iônicas com sais presentes
 Forças eletrostáticas e atração e repulsão

 Também são determinantes da solubilidade das

proteínas são: pH, temperatura e força iônica.
1.3 Precipitação Isoelétrica

 Concentração por precipitação isoelétrica.

 Ponto isoelétrico: pH no qual a proteína apresenta
carga líquida zero.
 Quanto maior o caráter iônico de uma proteína,
maior será sua tendência a solvatação.
 Ex.: Hialouronidase – ácido acético/clorídrico
(pH=2,1)
1.3 Precipitação Isoelétrica

 Efeito do pH
1.3 Precipitação com Sais Inorgânicos

 Concentração por precipitação com sais

inorgânicos:
 Cloreto de sódio
 Sulfato de amônio
 1.3 Precipitação com Sais Inorgânicos

 Concentração por precipitação com sais

inorgânicos:
 Salting in: uso de sal em baixas concentrações (0,5 a
1,0 mol.L-1).

Atração entre
Aumento da
íons da Aumento da
Proteína + sal camada de
proteína e do solubilidade
hidratação
sal
1.3 Precipitação com Sais Inorgânicos

 Concentração por precipitação com sais

inorgânicos:
 Salting out: uso de altas concentrações de sal (acima
de 1,0 mol.L-1).

Diminuição da
Diminuição da
Aumento da Diminuição da interação da
solubilidade e
concentração atividade de água e grupos
precipitação da
iônica água polares da
proteína
proteína
1.3 Precipitação com Sais Inorgânicos

 Concentração por precipitação com sais

inorgânicos:
 Vantagens do sulfato de amônio:
 Barato e de fácil obtenção
 Não é tóxico
 Alta solubilidade mesmo em baixas temperaturas.
 Efeito estabilizante em algumas proteínas.
 Previne ação bacteriana e proteolítica.
1.3 Precipitação com Solventes

 Concentração por precipitação com solventes

orgânicos (acetona e álcool/baixa temperatura):

 Diminui a solubilidade da proteínas por baixar a

constante dielétrica da solução ou seja diminui a
atividade de água.
 Constante dielétrica: medida da polaridade do
solvente, ou seja, da capacidade que ele apresenta
de se colocar entre dois íons de cargas opostas e
separá-los, solvatando-os.
1.3 Precipitação com Polímeros
 Concentração por precipitação com polímeros:

 Polietilenimidas e polietilenoglicóis.

 Muitas enzimas precipitam com concentrações de

polímero variando entre 15 e 20%.
 Acredita-se que as moléculas de polímero formem
complexos com as proteínas.
1.3 Concentração por ultrafiltração

 Usada para concentração, dessalinização e

fracionamento.
 Uso de membrana semi-permeável para separação
da moléculas de solventes das moléculas da enzima.
 Força motriz:
 Diferença de pressão.
1.3 Concentração por ultrafiltração

Vantagens da ultrafiltração:

 Utiliza baixas pressões hidrostáticas;

 Não ocorre mudança de fase;
 Não utiliza reagentes químicos;
 Mantém pH da solução concentrada;
 Evita desnaturação e inativação das enzimas.
1.3 Concentração por ultrafiltração

Desvantagens da ultrafiltração:

 Concentração por polarização (acúmulo de moléculas

grandes perto da superfície da membrana);
 Formação de camadas de géis na membrana (reduz-se
através da manutenção de escoamento turbulento ou
laminar com alta vazão);
 fouling (deposição) na membrana (especialmente
agentes anti-espumantes usados nas fermentações
ocasionam depósitos).
1.3 Concentração por Liofilização

 Concentração dos sais presentes na solução

inicial – podendo provocar perda da atividade;

 Enzima ativa na forma de pó;

 Aplicação de aditivos como lactose, trealose e

manitol.
 2.1 Purificação das enzimas

Cromatografia:

 Separação diferencial dos componentes.

 A fase móvel força a mistura de proteínas a migrar
através da fase estacionária;
 As enzimas que possuem maior atração pela fase
estacionária irão migrar de forma diferenciada das que
tem menor afinidade pela fase estacionária.
Cromatografia por exclusão de
tamanho

Dextrana
Agarose
Poliacrilamida
Cromatografia de exclusão por
tamanho
Cromatografia de exclusão por
tamanho
 Cromatografia de Troca Iônica
A cromatografia de troca iônica explora diferenças de carga elétrica das
moléculas, sendo amplamente utilizada para a purificação de proteínas.

pK=4,0

pH=5,0

Existem resinas trocadoras de ânions, que apresentam grupamentos

químicos positivos, em geral contendo um N quartenário. Já as resinas
trocadoras de cátions apresentam grupamentos químicos negativos, como
carboxilas.
 Cromatografia de Troca Iônica

pK=9,5

pH=8,0
2.1 Purificação das enzimas

 Eletroforese:
 Baseado na migração das partículas quando
submetidas a uma campo elétrico.
 Tipos: papel e gel.
 A migração depende:
 Carga elétrica;
 Forma;
 Tamanho.
2.1 Purificação das enzimas

 Eletroforese em papel
2.1 Purificação das enzimas

 Eletroforese com SDS (sódio dodecilsulfato):

Estimativa do peso molecular.
 Ação do SDS:
 Desnaturação
 Atribui carga (-)
2.1 Purificação das enzimas

 O grau de pureza da enzima irá depender da

finalidade de uso.

 Para uso medicinal e analítico ou para

aplicação em pesquisa, as enzimas devem ser
extremamente puras.