ENZIMOLOGIA- PROVA FINAL

Produção de enzimas de origem animal:

Elas são obtidas de tecidos animais específicos.
Tecidos secos  triturados  desintegração  adição de agua ou tampão 
remoção de insolúveis  filtração ou centrifugação
 Pancreatina: obtida no pâncreas do porco (amilolitica – converte amido
em açúcar; proteolítica; lipolítica)
Trituração  secagem  purificação
 Pepsina: obtida na mucosa do estomago do porco
Fatiar  HCl (Ph2 – 16hrs)  40-45°C  modificação de pepsinogenio em
pepsina  filtração  secagem  concentração  resfriamento + etanol
preciptação da pepsina  secagem
 Resina: obtida do suco gástrico do 4º estomago do bezerro
-Pode ocorrer contaminação por pesina; tem maior eficiente em abate ou fetos
bovinos; pode ser apresentada como liquida, em pó ou em pasta.
 Catalase: obtida no estomago do boi ou do porco, sangue de animais,
fungos e bactérias
Maceração  agitação + acetona + TA  filtração  acetona  precipitação
de catalase  filtração e centrifugação
 Papaina: enzima utilizada para clarificação da cerveja, amaciamento
da carne, extraída do látex do mamão verde (o látex fresco tem alta
atividade proteolítica – fácil oxidação); tem curto tempo de
armazenamento; extraído por incisões na casca
 Bromelina: utilizado na clarificação da cerveja, amaciamento da
carne, obtida no talo do abacaxi; passa pelos processos de moagem,
prensagem, filtração e precipitação.
 Ficina: utilizada na clarificação da cerveja, amaciamento da carne,
obtida pelo látex de Figus
 Malte: (protease, lipase, oxirredutase, hemicelulase, amilase)
utilizado para fabricação de bebidas alcoolicas; origem: cevada
(aumento da umidade da cevada e depois germinação resulta no
malte)
**A qualidade do malte depende do seu termo de germinação.
PURIFICAÇÃO DE ENZIMAS
A purificação das enzimas pode ter finalidade industrial (grandes
quantidades) ou terapêutica (necessita de alto grau de pureza). No processo de
purificação é necessário etapas em baixas temperaturas (4°C) para evitar
perdas, armazenamento em gelo ou congelamento e o uso de tampões para
evitar a desnaturação ou inativação da enzima.
**Quanto maior a pureza de uma enzima, maior o numero de etapas em que
ela foi submetida – quando for necessário uma grande quantidade de enzimas,
deve submete-las a menos processos
**Enzimas mais puras são menos eficientes, perde rendimento – a cada etapa
que a enzima é submetida, perde-se atividade, ou seja, para aumentar seu
rendimento ela precisa ser submetida a menos etapas.
**Para estabilização da enzima deve-se adicionar substrstos e cofatores
-Enzimas intracelulares são facilmente oxidadas (necessita de agentes
redutores) – quando ela é exposta a ambientes com muito O2, ela é degradada
(não adaptável a ambientes oxidantes)
-Purificação a partir da mistura: 1) reduzir o volume (preciptar – sais ou
solventes orgânicos), 2) interações eletrostáticas (cromatografia de troca
iônica), 3) aumentar resolução, diminuir contaminação (cromatografia em gel
ou afinidade)
Extração das enzimas:
 Enzimas extracelulares: é necessário remover o material solido (extrato
bruto)  filtração  centrifugação (sem lise)
 Enzimas intracelulares: tem necessidade de passar por um pré
tratamento (remoção de gorduras, picar tecidos  homogeneização),
precisa passar pela lise celular (processo de ruptura da membrana
plasmática da célula e a liberação do material de dentro para o meio
exterior da célula) – precisa de equipamentos robustos (cisalhamento e
impacto) **MIXERS OU BLENDERS
-Agitação com abrasivos: pequenos volumes e alumina (pistilo e almofariz) /
grandes volumes (aparelhos com perolas de vidro e agitação) – gera calor em
câmara fria
-Extrusão solida e liquida: câmaras sob pressão
-Congelamento/descongelamento: necessário para o rompimento da
membrana plasmática; tipo de célula, idade e Ts são importantes (células
jovens são mais difíceis de romper a membrana); quanto maior o tempo de
congelamento/descongelamento, maior é o dano causado na célula.
PROCESSO DEMORADO E DIFICIL EM LARGA ESCALA.
-Choque osmótico: (célula usada não pode ser desnaturada) centrifugação das
células  suspender em solução de sacarose20%  centrifugar 
ressuspender em agua pura 4°C
-Enzimas hidroliticas de parede: feita em pequena escala por causa do alto
custo e tem como desvantagem retirar a enzima adicionada (tripsina, lisozima)
-Ultrassom: alta frequência, gelo, baixa concentração celular
-Tratamento alcalino: enzima fica estável em ph alcalino (11), tem baixo custo.
Microorganismos, proteases e pirogenio (inativos/eliminados)
-Detergentes e solventes: dissolvem a membrana celular liberando as enzimas.
Depende da temperatura e tem ação mais eficiente com solvente (acetona) –
Sais biliares, laurilsulfato de sódio
Purificação das enzimas:
1)Purificação baseada na solubilidade: a solubilidade em solvente depende da
distribuição de cargas presentes; a precipitação ocorre pela interação de ions
induzida por ph, força iônica com adição de solventes orgânicos ou polímeros e
o precipitado pode ser recuperado pela centrifugação (ressuspender em
tampão  dessalinização – dialise ou filtração). **Temperatura interfere na
solubilidade
- Precipitação isoelétrica: ocorre atração eletrostática entre enzimas neutras e
resulta em precipitado. Esse método é utilizado para retirar proteínas
indesejáveis, mas tem alto risco de desnaturação
-Adição de sais (NaCl ou (NH4)2SO4): a força iônica que ocorre na adição dos
sais resulta em agregação e precipitação
-Adição de solventes orgânicos miscíveis em agua: a adição desses solventes
resulta em uma baixa solubilidade e uma alta agregação das enzimas.
(depende do tamanho da molécula e precisa de baixa temperatura) –
inflamáveis
-Polimeros orgânicos: semelhante ao de solventes orgânicos
 Purificação baseada na carga: cromatografia de troca iônica (cargas + -).
Precisa de alterações de ph para regular o grau de adsorção
 Purificação baseada no tamanho das moléculas: as moléculas são
separadas por tamanho. Cromatografia em gel ou de exclusão em gel,
filtração em gel
 Purificação baseada na afinidade: cromatografia de afinidade, ligantes
fixados em matriz e ligação reversível com a enzima.
 Concentração: tem a finalidade de diminuir e aumenta a concentração
proteica e evitar adsorções não especificas em matrizes, pode ocorrer no final
ou entre as etapas de purificação.
-Metodos: adição do polímero (remove por centrifugação), remoção do
solvente, remoção de agua (liofilização – perda da atividade enzimática x
enzima em pó mais estável)
Processos fermentativos
Fermentação descontinua: (sistema fechado) nesse processo, ocorre
aeração e controle do ph através da adição de ácidos e bases, e o inoculo
passa por inúmeras fases. Todo substrato é fornecido no inicio da fermentação
(só ajustadores de ph, O2 e antiespumante.
-Desvantagens: baixos rendimentos se o substrato exercer efeito de inibição,
repressão ou induzir produção de outros produtos; formação eficiente do
produto ocorre somente durante uma parte do ciclo de fermentação (menor
produtividade)
-Tempos mortos: biorreator em preparo, esvaziamento/enchimento do
biorreator, lavagem e esterilização
-Vantagens: menor risco de contaminação, facilidade no controle
-A alta concentração de açúcar pode provocar a inibição da respiração
microbinada, aumentando a produção de etanol
-Quantidade de biomassa alcançada depende da concentração inicial de
substrato limitante do crescimento e da eficácia do microrganismo para
converter o substrato em material celular.
-Mosto ou meio de fermentação: meio de cultura que propiciara o crescimento
microbiano e a obtenção do produto desejado
-Inoculo: volume de suspensão de microrganismo de concentração adequada
capaz de garantir a fermentação de um volume de mosto
-Tipos de processos:
 1 dorna – 1 inoculo: menor risco de contaminação, ressalva se elevado
teor de substrato provocar prejuízos
 Recirculação de microrganismo: reaproveitamento da batelada anterior.
Sedimentação (cervejarias) ou centrifugação (usinas). Contaminação
elevada
 Cortes: parte do fermentado da dorna anterior é transferido para outra e
completados os volumes dos dois. Contaminação/rendimento.
Fermentação descontinua alimentada ou batelada alimentada: técnica em
processos microbianos, onde um ou mais nutrientes são adicionados no
fermentador durante o cultivo e em que os produtos permanecem ate o final da
fermentação. (podem ser adicionados gradualmente á dorna ou apenas os
chamados aditivos. Tem como finalidade minimizar o efeito do controle do
metabolismo celular, prevenindo a inibição por substrato ou por precursores;
minimização da formação de metabolismo toxico
-Aplicação: produtos de levedura, glicerol, acetona, acido lático etc
-Vantagem: controle da concentração do substrato, previne inibição, minimiza
formação de matabolismos tóxicos, consegue manter constante a concentração
do substrato, produção de elevadas concentrações de células, melhor controle
das condições de substrato durante a fermentação, melhor controle dos
produtos obtidos, opera o fermentador para longos períodos.
-Desvantagem: maior risco de contaminação
-Pode ser controlado pela variação de ph
*Nutrientes como metanol, etanol, acido acético, inibem o crescimento celular,
mas eles tem esse efeito reduzido pelo processo descontinuo
alimentado,através do controle das concentrações destes nutrientes.
-Classificação:
  Processo descontinuo repetitivo: parte do meio de cultura é removido do
sistema em certo momento e outro é adicionado. Produção de
leveduras e de antibióticos.
 Processo descontinuo estendido: um meio de crescimento
complementar é adicionado durante a fermentação sem retirar-se a
cultura ate o fim do processo (duração da fermentação é limitada pelo
volume do fermentador)
**A glicose é rapidamente metabolizável e acaba inibindo a expressão de
genes que codificam enzimas relacionadas ao metabolismo de outras fontes de
carbono e esse efeito pode ser evitado pelo processo descontinuo alimentado,
pois é possível manter a concentração de glicose baixa no meio, restringindo o
crescimento celular e desreprimindo a biossíntese de enzimas.
**Indução: ocorre quando na presença de algum substrato, os genes que
induzem a formação de bioproduto são deprimidos, liberando a síntese da
enzima
**SACCHAROMYCES CEREVISIAE (levedura) – produção de etanol: fonte de
obtenção de enzimas
Fermentação continua: ocorre uma alimentação continua de meio de cultura a
determinada vazão constante, mantendo o volume de reação constante.
Sistema em estado estacionário ou regime permanente: concentração de
células, de substrato limitante e de produto são constantes.
*Deve-se evitar formação de espuma
-Vantagens: aumento da produtividade, fermentação de caldo uniforme,
possibilidade de melhor padronização da purificação, células no mesmo estado
fisiológico, menor necessidade de mao de obra
-Desvantagens: maior investimento inicial, possibilidade de mutações genéticas
espontâneas, maior possibilidade de contaminações (sist..aberto), restrito para
produção de enzimas e antibióticos (assepsia)
Fermentação em estado solido ou semissólido: processo refere-se a cultura
de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz solida.
-Microrganismos mais utilizados: fungo
-Vantagens: menor consumo de agua, agitação continua não é necessária,
menor produção de residuosliquidos
-Desvantagens:dificuldade no controle de parâmetros operacionais, dificukdade
na dissipação do calor
PRODUÇÃO DE ETANOL:
-Vias de obtenção: destilação, síntese e fermentação
-Fases da via fermentativa: preparo do substrato, fermentação (transforma
açúcar em etanol) e destilação (purificação)
-Materias primas açucaradas: mono e dissacarídeos (fermentação ocorre após
hidrolise) // outras: melaço, cana de açúcar (ideal cortare moer no mesmo
dia),mosto de melaço (diluído em agua), mosto de cana (realizar clarificação-
aquecer, decantação e filtração – decanta melhor e espuma menos)
*Beterraba também pode ser utilizada na produção de etanol e milho também
(produção do açúcar)
-Aerobiose: biomassa, CO2, H2O
-Fermentativo: Etanol e CO2
-Fatores que afetam a fermentação: temperatura (26 a 35-38°C), pressão
osmótica, ph (ideal 4-5), oxigenação, nutrientes minerais e orgânicos,
inibidores, concentração da espécie SACCHAROMYCES CEREVISAE,
linhagem, concentração e contaminação
-Fases da produção de etanol:
 Preliminar: nessa fase ocorre multiplicação celular intensa, pequena
elevação da T, pequena produção de CO2. O tempo dessa fase
depende da quantidade de inoculo
 Tumultuosa: desprendimento elevado de CO2. Maior tempo de duração,
T elevada rapidamente, densidade diminui, aumenta a quantidade de
álcool e eleva a acidez
 Complementar: diminuição da liberação de CO2, menor agitação e
diminuição da T. Aumento mais notável na proporção de álcool
-Controles:
 Tempo de fermentação;
 Odor – Normal  odor de frutas / anormal  odor de ranço, de acido
 Aspecto da espuma
 Drosofilas: com infecção acética
 Temperatura
 Densidade do mosto: decresce ao longo da fermentação;
 Açucares no mosto: consumidos de acordo com a curva da densidade
 Acidez do substrato: normal  suave
 Sistema de fermentação: reaproveitamento do inoculo (decantar), cultura
pura, recuperação de leveduras (centrifugae)
 Destilação: separar do etanol
 Retificação: separação do álcool das impurezas
 Desidradação
*Em cultivos descontínuos, as elevadas concentrações de açucares podem
resultar numa repressão chamada EFEITO CRABTREE, na qual as
enzimas da respiração microbiana são inibidas e a produção de etanol
aumenta.
*Oxigenio puro promove aumento na produção de etanol e o crescimento
celular foi inibido
PRODUÇÃO DE CERVEJA
A cerveja é obtida por fermentação do malte da cevada, realizada por
leveduras, sendo acrescentado o lúpulo e agua de boa qualidade.
 -Influencias e controles:
 Cepa da levedura empregada;
 Tolerancia ao stress, viabilidade e vitalidade e concentração celular
do onoculo;
 Concentração e natureza do nitrogênio assimilável, variedade e
concentração de açucares no mosto e disponibilidade de ions
metálicos;
 Temperatura, ph, oxigênio dissolvido e densidade do mosto.
**Grandes quantidades de O2 fazem com que a levedura se multiplique muito,
ou seja, não fermenta
-Materias primas:
 Agua: é necessário 10L de agua para fabricar 1L de cerveja; ph idela
6,5-7
 Malte: é originado da cevada – germinação parcial do cereal; rico em
açúcar
 Lúpulo: responsável pelo aroma e sabor amargo (cervejas com + lúpulo
são mais amargasse e mais aromáticas) – o lúpulo tem atividade
antimicrobiana o que ajuda na conservação da cerveja
 Adjuntos: antioxidantes, estabilizantes (aumenta viscosidade),
acidulantes (aroma e sabor), antiespumantes e leveduras
 Leveduras: SACCHAROMYCES CEREBISITAE (alta fermentação) e
SACCHAROMYCES UVARUM (baixa fermentação)
**A diferença entre a cerveja e o chopp, é que a cerveja é pasteurizada (mata
os microrganismos), ou seja, tem maior durabilidade
-Processo feito em 4 etapas: mosturação (preparo do mosto); fervura;
fermentação e maturação
-Processo clássico descontinuo: dornas fechadas para evitar a perda de CO2,
rigoroso controle da T
1)Mosturação (moagem da cevada): cozimento dos grãos  filtração 
clarificação do mosto
-Preparo do inoculo: aerobiose  CO2/H20/Biomassa ----- Microaerofilia 
etanol e CO2
2)Fermentação: são colocadas as leveduras responsáveis pela produção do
álcool na cerveja. (Temperatura é importante)
Preparo do mosto  espuma  bombear mosto O2  estimulo multiplicação
 formação da espuma (retirar)  fermento  CO2 captado e recolocado no
acabamento
3)Maturação: onde ocorre as mudanças no sabor, aroma e clarificação da
cerveja. Fermentação complementar, adicionar antioxidantes
4)Resfriamento: igual ou inferior a 0°C
5)Acabamento: clarificação e carbonatação
6)Embalagem: armazenar em baixa T

ARTIGOS SOBRE CERVEJA – ANOTAÇÕES

-Cerveja: bebida de baixo teor alcoolico preparada a partir da fermentação de
leveduras (fungos - unicelular) do malte da cevada, contendo lúpulo e agua.
-pode utilizar milho, arroz e trigo
-leveduras reproduzem (germulação ou brotamento) mais rápido que bolores,
mais eficientes em alterações químicas
-principais propriedades para serem consideradas boas produtoras de
cervejeira: velocidade rápida de fermentação sem crescimento celular
excessivo, utilização eficiente da maltose e maltotriose, boa tolerância ao
strees, floculação ideal, boas características de manuseio.
-Preparacao do mosto: produtos vindos dos cereais ricos em carboidratos que
são cozidos e durante o processo, o amido do malte é transformado em açúcar,
formndo um liquido turvo e grosso = malte. O malte é filtrado e novamente
fervido e assim é adicionado o lúpulo, que da o sabor e aroma. Em seguida o
mosto é resfriado.
- os grãos passam por germinação controlada (amilases) – reduz o amido em
acucares fermenteciveis
-Aspectos que precisam ser citados na fase fermentativa: seleção do
microrganismo, inoculum, cinética fermentativa, contaminação, temperatura,
biorreatores, volume de mosto etc.