Técnicas de Purificação

Técnicas de Purificação
Introdução
• Meios de fermentação:
- produtos extracelulares (solúveis e insolúveis),
- produtos intracelulares,
- fragmentos de células,
- microrganismos intactos
- substratos ou demais componentes não convertidos em produto.
• Diversidade: métodos de separação passíveis de utilização é muito vasto.

processo de separação e/ou purificação composto altamente
suspensão diluída
purificado
• Quatro etapas similares, que ocorrem seqüencialmente:
- remoção de material insolúvel
Separação
- separação dos produtos
- purificação
Purificação
- polimento (geralmente associado a cristalização)
Etapas de Recuperação
Separação
• Operações Unitárias:
- centrifugação
Remoção de material insolúvel
- filtração
- adsorção, Separação de produtos
- extração com solvente
• Duas etapas vêm sendo combinadas em um único estágio;
• Nota-se um grande aumento da concentração do produto nesta fase

Separação
• Enzimas extracelulares:
- Resfria-se o meio fermentado a 5°C (estabilidade e evitar contaminação)
- pH ajustado
• Fungos filamentosos: - centrifugação

- ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)
• Leveduras e Bactérias: - prévia floculação (sulfato de alumínio, CaCl2)

- centrifugação
- ou filtração (filtro-prensa/ filtro rotativo a vácuo)
Separação
• Enzimas hidrolíticas: centrifugação
- bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da

protease subtisilina)
- bactérias gram-negativas como Klebsiella pneumoniae (produtora da
pululanase): presença de membrana externa – complicações: liberação
apenas parcial da enzima no meio.
Extração
liberação da enzima: destruição
Enzima localizada na parte parcial ou total da célula
externa da membrana celular (exemplo: autólise das células a
(mas não é extracelular) 50oC durante 14 horas).
• Obtenção de enzimas intracelulares:
Técnicas de lise celular: - métodos físicos,

- métodos químicos,
- métodos enzimáticos
Extração
• Métodos enzimáticos:
- Utilização de enzimas que catalisam a digestão de parede

celular: Lisozima – bactérias
Glucanase, tripsina e protease – leveduras
- Pouco usado industrialmente: alto custo

Extração Tratamento prévio com EDTA
Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicas

beta 1,4 entre resíduos do ácido N-acetilmurâmico
(Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num
pepitídeoglicano
Extração
Glucanase, tripsina e protease – leveduras

Extração
• Métodos químicos:
- tratamentos com bases (NaOH) – enzima tolerante a alto pH
-choque osmótico (variação da concentração de soluto presente no

tampão):
Extrato resultante com pouca contaminação
Bactérias Gram-positivas: alta pressão osmótica interna
- tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sódio,

triton)
Agem sob condições de baixa força iônica, combinando as
lipoproteínas da membrana para formar micélios
- tratamento com solventes orgânicos (álcool isopropílico, etanol).

Extração
• Métodos físicos:
- Congelamento / descongelamento: formação de cristais de

gelo intracelulares
Demorado
Pode inativar enzima
- Moagem com abrasivos: moinhos vibratórios

com esferas de vidro
largamente empregada
Opera em batelada ou contínuo
Necessita de sistema de resfriamento
- Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais

Extração
• Métodos físicos:
- Cisalhamento líquido: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão
- Sonicação: aparelhos de ultrassom

altíssimas frequências
ruptura das células por cavitação
Não muito aplicada em escala industrial
O extrato enzimático contém muitos componentes celulares. Em particular, as

células bacterianas lisadas liberam elevadas quantidades de ácidos nucleicos.
Extração
• Extração a partir de Tecidos Animais e Vegetais
- Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em leveduras
Homogeneização do tecido selecionado em uma solução tampão

adequada é a técnica mais amplamente empregada.
Segundo passo: se utiliza a centrifugação diferencial para selecionar a
subfração celular apropriada.
- Tecidos vegetais:
Forças necessárias são elevadas
Presença de compostos fenólicos facilmente oxidados
Etapas de Purificação
•As características das etapas de um processo de purificação são, em grande

parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicação
• Existe necessidade para a purificação completa de uma enzima?
•Maioria das aplicações: suficiente um menor grau de purificação ainda que

existam algumas atividades contaminantes desde que não afetem substrato(s),
produto(s) ou enzima(s) envolvido(s) em um processo específico.
•Existem algumas aplicações (na medicina clínica, área farmacêutica, análises

específicas, projeto de biosensores, engenharia genética) onde é essencial que
a proteínas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas.
•Cuidados devem ser tomados para que ao passar de uma etapa a outra
mínimas alterações nas condições de estabilidade, pH, temperatura, etc.
sejam promovidas.
•As enzimas são moléculas de elevado peso molecular, cujas funções

dependem de uma estrutura altamente ordenada.
•Tamanho, carga, hidrofobicidade,

solubilidade e atividade biológica
são as principais características
proteicas utilizadas na etapa de
purificação das proteínas
Concentração
Precipitação
- A solubilidade de uma proteína é o resultado de:

interações polares com o solvente aquoso,
interações iônicas com os sais presentes, forças
eletrostáticas de atração e repulsão.
-O desempenho do processo de precipitação depende também da composição

da solução, incluindo as propriedades das demais proteínas presentes (co-
precipitação).
-Outros fatores determinantes na solubilidade das proteínas: pH, temperatura

e força iônica.
Concentração
• Precipitação Isoelétrica:
- Ponto isoelétrico:
pH no qual as proteínas apresentam a carga líquida igual a zero.
não ocorre migração das molécula se submetidas a um campo elétrico.
Abaixo do PI: forma catiônica
Acima do PI: forma aniônica.
- Quanto maior o caráter iônico:

maior a tendência à solvatação.
Concentração
• Precipitação com sais inorgânicos:
-Sais inorgânicos neutros (NaCl, (NH4)2SO4) que promovam a precipitação

seletiva das proteínas.
- Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das proteínas.
-Distribuição de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula de

proteína: afeta enormemente sua solubilidade frente a vários solventes.
Grupos hidrofóbicos: papel importante no comportamento das moléculas
proteicas, devido à carga e aos grupos polares que apresentam;
Concentração
- A força iônica mede a concentração das cargas em solução.

Variação da força iônica (concentração do sal) no meio.
Solubilidade aumenta exponencialmente com a concentração do sal,
passa por um máximo e depois decresce.
Concentração
- Salting-in:
forças de atração entre os íons da proteína e os íons do sal;
íons do sal: muito hidratados - contribuem para o aumento da camada de
hidratação da molécula, favorecendo o aumento da solubilidade.
- Salting-out:
redução das interações Ptn´s mais
Aumento da decréscimo
entre a água e os susceptíveis à
concentração na atividade
grupos polares das aglomeração
iônica da água
proteínas
O fenômeno da salting out é bastante apreciável no ponto isoelétrico, onde a
repulsividade eletrostática passa por um mínimo.
Concentração
Sulfato de amônio:
- barato e de fácil obtenção;
- não é tóxico;
- alta solubilidade mesmo em baixas
temperaturas;
- efeito estabilizante em algumas proteínas,
sendo normalmente utilizado no processo de
armazenagem de enzimas comerciais;
- alta concentração deste sal previne ação
proteolítica e bateriana, o que reduz as perdas de
atividade enzimática.
OBS: a adição do sal deve ser lenta e sob
agitação para favorecer a homogeneização
Concentração
• Precipitação com solventes orgânicos:
-A adição de solventes orgânicos (acetona e álcool): diminui a sua solubilidade.

abaixamento da constante dielétrica da solução, ou seja, diminuição da
atividade da água.
-Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade

que ele apresenta de se colocar entre dois íons de cargas opostas e separá-los,
solvatando-os.
Constante dielétrica da água: muito elevada
A água separa os íons de carga oposta, solvatando-os, e mantendo a
proteína em solução.
O solvente já o faz com mais dificuldade, permitindo maior atração
entre as moléculas proteicas.
Concentração
• Precipitação com solventes orgânicos:
- Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC);
- O uso de solventes tem diminuído nos últimos anos;
- Mais usados: metanol, etanol e acetona – inflamáveis;
- Vantagem: recuperação do solvente para reutilização.

Concentração
• Precipitação com polímeros:
- Polietilenimidas e polietilenoglicóis de diferentes pesos moleculares.
-Mecanismo de precipitação: é similar ao existente com solventes orgânicos e

resulta da mudança na solvatação das moléculas proteicas pela água.
-Acredita-se que as moléculas de polímero ocupem o lugar das moléculas

proteicas na solvatação.
-Muitas enzimas precipitam com concentrações de polímero variando entre 15 e

20%.
Concentração
• Ultrafiltração:
- Princípio: Uma membrana semi-

permeável permite a separação das
moléculas de solvente das moléculas
enzimáticas grandes porque apenas as
moléculas pequenas podem penetrar na
membrana quando a pressão osmótica é
excedida.
-O processo de ultrafiltração é
empregado para concentração,
dessalinização e fracionamento.
-A força motriz é a diferença de pressão

entre os lados da membrana.
Concentração
Vantagens do processo:
- utiliza baixas pressões hidrostáticas;
- não ocorre mudança de fase;
- não utiliza reagentes químicos;
- mantém força iônica e pH da solução concentrada;
- evita desnaturação e inativação das enzimas.
Desvantagens:
- Concentração por polarização (acúmulo de moléculas grandes perto da
superfície da membrana),
- Formação de camadas de géis na membrana (reduz-se através da
manutenção de escoamento turbulento ou laminar com alta vazão)
- fouling (deposição) na membrana (especialmente agentes anti-espumantes
usados nas fermentações ocasionam depósitos).
Concentração
- Materiais: Acetato de celulose e polímeros orgânicos (polisulfonas e

polipropileno)
- Fluxo inversamente proporcional a resistência. Como minimizar a resistência?

- Aumentando o tamanho dos poros (até o máximo)
- Aumentando a quantidade de poros;
- mínima expessura da membrana;
- Máxima hidratação da membrana;
- Mínima viscosidade da solução;
Concentração
• Liofilização:
- Concentração dos sais presentes na solução inicial
- Pode provocar perda na atividade enzimática
- Uma vez ativa em forma de pó: mais estável do que em solução aquosa
- Cuidado: não descongelar durante o processo

Cromatografia
•A cromatografia pode ser considerada como uma separação diferencial dos
componentes de uma amostra entre uma fase móvel e uma fase estacionária.
•Fase estacionária: partículas esféricas de um material insolúvel empacotado

em uma coluna;
•A mistura de enzimas é introduzida na coluna pela fase móvel e forçada a

migrar através da coluna;
•As enzimas que possuem maior atração pela fase estacionaria irão migrar de
forma diferenciada das que tem maior afinidade pela fase estacionária.
Cromatografia
•Cromatografia de gel-filtração (permeação em gel, exclusão por tamanho ou
peneira molecular)
- Para o fracionamento e purificação de proteínas e aplicável à determinação

de seus pesos moleculares.
- Moléculas são separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em

solução, utilizando matrizes (ou géis) com porosidade definida.
Estabilidade, rigidez, tamanho de partícula, distribuição de poros e inércia
química são fatores que podem afetar o tamanho da coluna, a vazão a ser
adotada e a eficiência de separação.
- Definição: partição difusional das moléculas de soluto entre a fase

móvel, constituída pelo solvente, e a fase estacionária formada pelos poros
do gel.
Cromatografia
• Cromatografia de gel-filtração
- Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligações cruzadas,

contendo poros de diferentes tamanhos que permitem o acesso de apenas
algumas moléculas.
Ex.: matrizes formadas po

ligações cruzadas de dextranar s
(Sephadex):
Moléculas maiores: eluídas mais
rapidamente;
Moléculas menores: movem-se
mais lentamente por terem um
maior caminho a percorrer.
Cromatografia
-Escolha do gel: depende da finalidade

- Separação de moléculas maiores (enzima) de menores (sais): geis
com poros pequenos
- Separação de moléculas de tamanho próximo: géis que fracionam
várias faixas de peso molecular
- Parâmetros críticos para a otimização do processo de gel-filtração:

- volume da amostra;
- concentração da amostra;
- vazão adotada;
- altura do leito da coluna.
Cromatografia
- Vantagens:
- não utilização de energia,
- forças cisalhantes desprezíveis,
- sistemas simples de automação
- altas recuperação aliadas a máxima resolução.
- Desvantagens:
- quantidade de amostra aplicada: máx 1-2% do volume total da coluna;
- géis, Sephadex e Sepharose (agarose), tendem a empacotar;
- problemas de diluição no processo de eluição da coluna.
Cromatografia
- Equipamento: coluna,
detector de UV
coletor de frações
Controle de fluxo (bomba peristáltica)
-Utilizada para etapas finais de purificação, mas pode ser usada na

dessalinização e na determinação de pesos moleculares.
Cromatografia
• Cromatografia de Troca-iônica
-Fracionamento de substâncias biológicas que apresentem semelhanças em

suas propriedades químicas e fisico-químicas,
-Método de fracionamento baseado na fixação de substâncias carregadas a

um suporte que contém uma carga oposta.
A separação ocorre porque as interações eletrostáticas entre os grupos são

reversíveis e dependentes da afinidade de cada substância pelo trocador.
Esta afinidade é função do pH do meio, da temperatura, da força iônica, do

tampão, etc.
Cromatografia
-Suportes: trocadores iônicos ou resinas, sendo normalmente empregados em

colunas.
As resinas são obtidas pela introdução de grupamentos polares em matrizes
insolúveis em água.
Ex.: Celulose, poliacrilamida, géis de dextrana e copolímeros de estireno e
divinilbenzeno.
- Classificação:
Permutadores de cátions:
grupamentos ácidos (ativos em pH > pK)
Permutadores de ânions:
grupamentos básicos (ativos em pH < pK)
Cromatografia
- Ativação do trocador catiônico:

tratamento com
Trata-se a lava-se trata-se lava-se tampão cujo pH
resina com com água com uma com água deve ser superior
um ácido deionizada base forte deionizada ao pK do grupa-
forte (HCl) (NaOH)
mento trocador
Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma

sódica, ou seja:
R-COOH NaOH R-COO- Na+

Forma Inativa Forma Ativa
Cromatografia
- Ativação do trocador aniônico:

tratamento com
trata-se lava-se Trata-se a lava-se tampão cujo pH
com uma com água resina com com água deve ser inferior ao
base forte deionizada um ácido deionizada pK do grupamento
(NaOH) forte (HCl)
trocador
Os trocadores catiônicos assim tratados são considerados ativos na sua forma

cloreto, ou seja:
R-COOH HCl R-CO+ Cl-

Forma Inativa Forma Ativa
Cromatografia
- Caso uma solução contendo um cátion X+ for colocada em contato com um

trocador catiônico ativo, este deslocará o cátion presente no trocador e será
fixado:
R-COO-Na+ + X+ R-COO- X+ + Na+
- Capacidade total de troca: função do tipo de trocador.

Importância deste parâmetro: se excedido, os íons não serão totalmente retidos.
“capacidade disponível ou real de troca”: capacidade de cada trocador em
uma determinada condição experimental (pH, natureza do tampão, força
iônica, etc.).
Cromatografia
- Escolha do tipo de resina

Proteínas com cargas positivas e negativas:
Carga é função do pH do meio,
Fator principal: estabilidade da
molécula nos diferentes pH’s.
Proteínas labéis: trocadores fracos
- Trocador catiônico (p.ex. CM-celulose),
uma força iônica baixa e um pH = 5 são
condições ideais para fixar as proteínas.
(pK típico dos grupos carboximetílicos = 4) e a maioria das proteínas se
encontrariam positivamente carregadas (abaixo do seu ponto isoelétrico).
Cromatografia
• Cromatoenfoque:
-As proteínas são eluídas de uma coluna de troca iônica utilizando-se um

enfraquecedor
- Efeito de enfoque: concentra a enzima de interesse
-A coluna é equilibrada com um tampão e, depois da aplicação da amostra, se

utiliza um segundo tampão, enfraquecedor de pH (para a eluição).
-Geração de um gradiente linear de pH “in situ” como conseqüência da

capacidade enfraquecedora da resina.
-Este gradiente de pH tem efeito de enfoque e as moléculas com o ponto

isoelétrico específico se concentram conjuntamente.
Cromatografia
• Cromatografia de adsorção:
-Os componentes da amostra serão retidos ou não sobre a superfície da fase

estacionária por forças do tipo van der Waals, ligações hidrogênio ou
interações eletrostáticas.
-O deslocamento das partículas adsorvidas será função da maior ou menor

interação destas com a fase estacionária.
Cromatografia
• Cromatografia de afinidade:
-Cromatografia de adsorção onde o suporte apresenta afinidade específica com

a substância a ser isolada.
- É capaz de fornecer um alto grau de purificação.
-Acopla-se covalentemente uma molécula ligante apropriada a uma matriz

insolúvel.
-A molécula ligante adsorve da solução a substância a ser isolada, sendo

eliminadas as que não apresentam nenhuma afinidade com o suporte.
- Dessorção: mudanças nas condições experimentais ([substrato] , coenzimas).
- Isolamento de substâncias de acordo com sua função biológica

Cromatografia
• Interação hidrofóbica:
-Observou-se: proteínas são retidas nos géis de afinidade contendo “braços” de

hidrocarbonetos (C2 a C10).
-As interações hidrofóbicas são mais fortes em alta força iônica sendo,
portanto, convenientemente utilizadas após a precipitação com sais ou
cromatografia de troca iônica.
-A eluição pode ser efetuada alterando o pH do solvente, a força iônica ou

usando um modificador orgânico (como etilenoglicol).
Cromatografia
• Eletroforese:
- Existência de grupos ionizáveis nas moléculas biológicas
- Quando em solução podem existir como espécies eletricamente carregadas.
-A taxa de migração destas partículas, quando submetidas a um campo

elétrico, é proporcional a força do campo e a carga efetiva das partículas e
inversamente proporcional ao atrito, dependo da sua forma e tamanho.
Cromatografia
• Eletroforese:
- Papel: simples e mais usado

Em alguns casos, não se obtém uma
boa separação.
- Em gel:
amido, agarose e poliacrilamida
Utilização de outros fatores como a
difusão e a separação por peneiramento
molecular, além do campo elétrico.
Mais conhecida: SDS-poliacrilamida usada
na determinação de peso molecular e da
pureza da amostra.
Cromatografia
• Eletroforese:
-Sódio dodecilsulfato (SDS): detergente aniônico que se liga fortemente as
proteínas causando sua desnaturação e fornecendo uma carga negativa constante
por unidade de massa.
- Os complexos SDS-proteína: movem-se para o anodo durante a eletroforese.
-Propriedades de peneira molecular do gel: mobilidades são inversamente
proporcionais ao logaritmo de seus pesos moleculares.
-Proteínas padrão de peso molecular conhecido são aplicadas: o peso molecular
das amostras proteicas pode ser determinado.
-Relevação do gel: Comassie Brilliant Blue, Bromofenol – ZnSO4 – ácido acético
ou Nitrato de prata.
Cromatografia
• Géis bidimensionais:
-Amostras são parcialmente separadas por diferenças entre pontos isoelétricos,
usando uma coluna cilíndrica.
-O anodo possui um pH menor que o catodo e um gradiente estável de pH é
mantido.
-Proteínas abaixo do seu pI: carregadas
negativamente e migrarão para o catodo,
até uma região onde o pH corresponda a
seu pI, cessando o movimento de
migração. Oposto: proteínas acima do
seu pI.
-Esta técnica é conhecida como

enfoque isoelétrico.
Cromatografia
• Géis bidimensionais:
- Após separação parcial: eletroforese em SDS no sentido perpendicular à
primeira separação - separação baseada nas diferenças de peso molecular.

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• Diversidade: métodos de separação passíveis de utilização é muito vasto.

• Duas etapas vêm sendo combinadas em um único estágio;

• Nota-se um grande aumento da concentração do produto nesta fase

• Fungos filamentosos: - centrifugação

• Leveduras e Bactérias: - prévia floculação (sulfato de alumínio, CaCl2)

- bactérias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da

• Obtenção de enzimas intracelulares:

Técnicas de lise celular: - métodos físicos,

- Utilização de enzimas que catalisam a digestão de parede

- Pouco usado industrialmente: alto custo

Ação da lisozima: hidrólise das ligações glicosídicas

Glucanase, tripsina e protease – leveduras

- tratamentos com bases (NaOH) – enzima tolerante a alto pH

-choque osmótico (variação da concentração de soluto presente no

- tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sódio,

- tratamento com solventes orgânicos (álcool isopropílico, etanol).

- Congelamento / descongelamento: formação de cristais de

- Moagem com abrasivos: moinhos vibratórios

- Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais

- Cisalhamento líquido: passagem por pequenos orifícios sob alta pressão

- Sonicação: aparelhos de ultrassom

O extrato enzimático contém muitos componentes celulares. Em particular, as

- Tecidos animais: similares às técnicas empregadas em leveduras

Homogeneização do tecido selecionado em uma solução tampão

•As características das etapas de um processo de purificação são, em grande

• Existe necessidade para a purificação completa de uma enzima?

•Maioria das aplicações: suficiente um menor grau de purificação ainda que

•Existem algumas aplicações (na medicina clínica, área farmacêutica, análises

•As enzimas são moléculas de elevado peso molecular, cujas funções

•Tamanho, carga, hidrofobicidade,

- A solubilidade de uma proteína é o resultado de:

-O desempenho do processo de precipitação depende também da composição

-Outros fatores determinantes na solubilidade das proteínas: pH, temperatura

- Quanto maior o caráter iônico:

-Sais inorgânicos neutros (NaCl, (NH4)2SO4) que promovam a precipitação

- Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das proteínas.

-Distribuição de grupos hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula de

- A força iônica mede a concentração das cargas em solução.

-A adição de solventes orgânicos (acetona e álcool): diminui a sua solubilidade.

-Constante dielétrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade

- Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC);

- O uso de solventes tem diminuído nos últimos anos;

- Mais usados: metanol, etanol e acetona – inflamáveis;

- Vantagem: recuperação do solvente para reutilização.

- Polietilenimidas e polietilenoglicóis de diferentes pesos moleculares.

-Mecanismo de precipitação: é similar ao existente com solventes orgânicos e

-Acredita-se que as moléculas de polímero ocupem o lugar das moléculas

-Muitas enzimas precipitam com concentrações de polímero variando entre 15 e

- Princípio: Uma membrana semi-

-A força motriz é a diferença de pressão

- Materiais: Acetato de celulose e polímeros orgânicos (polisulfonas e

- Fluxo inversamente proporcional a resistência. Como minimizar a resistência?

- Concentração dos sais presentes na solução inicial

- Pode provocar perda na atividade enzimática

- Cuidado: não descongelar durante o processo

•Fase estacionária: partículas esféricas de um material insolúvel empacotado

•A mistura de enzimas é introduzida na coluna pela fase móvel e forçada a

- Para o fracionamento e purificação de proteínas e aplicável à determinação

- Moléculas são separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em

- Definição: partição difusional das moléculas de soluto entre a fase

- Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligações cruzadas,

Ex.: matrizes formadas po