Separação e purificação de bioprodutos

As etapas do processo fermentativo

até o final da fermentação são
denominadas linha ascendente ou
“up stream” e a etapa de recuperação
do produto e tratamentos de resíduos é
chamada linha descendente ou
“down stream”
 Esquema geral do processo fermentativo
Preparo do meio Preparo de inóculo
(microrganismo)
-tratamento da matéria-prima
- mistura de nutrientes
-ajuste de pH Esterilização Ar
- tratamento térmico

Fermentação Linha ascendente

propriamente dita Processos à montante
“upstream”
(BIORREATOR)

Recuperação do Tratamentos de
produto resíduos
Linha descendente
Processos à jusante
“downstream” Produto
Definição: Separação do produto do meio
fermentado, colocando-o na forma mais pura possível
para a aplicação a que se destina.

o A etapa de recuperação de produto começa após a

determinação correta do final da fermentação.

o Esta deve levar em conta o máximo da produção

técnica e a máxima produção econômica.

o O produto de interesse pode estar no interior da

célula ou no meio de fermentação (lembrar que há
situações especiais).
SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE BIOPRODUTOS

Serão abordados os procedimentos envolvidos na

recuperação de bioprodutos do tipo insumos químicos e
biomoléculas e microrganismos, exemplificados a seguir:

Insumos químicos e biomoléculas

Álcoois Polímeros
Ácidos orgânicos Vitaminas
Solventes Aminoácidos
Antibióticos Enzimas
Hormônios Poliésteres
 Exemplos de enzimas

Protease de Bacillus Glicose oxidase

Amilase de Bacillus Invertase
Glicoamilase Lisozima
Glicose-isomerase Penicilina acilase
Renina microbiana Lactase
β-amilase Lipase
Amilase fúngica Xilanase
 Microrganismos

o Inóculo para processos fermentativos

o Microrganismos fixadores de nitrogênio
o Microrganismos para controle biológico
o Vacinas
o Probióticos
 É importante observar a escala de
aplicação dos diversos métodos de
separação e purificação de produtos
biotecnológicos:

o Escala de laboratório, normalmente para produtos

destinados a estudos acadêmicos e aplicações
específicas

o Escala industrial, quando se busca a obtenção de

grandes quantidades de produto para fins comerciais
SEPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE BIOPRODUTOS

Tem como objetivo recuperar o produto desejado de forma eficiente,

segura e reprodutível

Está incluída num conjunto de atividades que estão envolvidas no

desenvolvimento de um produto

Fundamental para a avaliação econômica

Considerar o atendimento a exigências da legislação

Lembrar que as técnicas são para produção em larga escala

Correspondem a um conjunto de operações unitárias

 Meio de cultivo com células
Recuperação
de Clarificação
(Separação das células/meio)
bioprodutos
Células Sobrenadante
(produtos intracelulares) (produtos extracelulares)

Remoção de fragmentos de
Rompimento de células
células

Fração sólida Sobrenadante

Separação/Concentração
de moléculas

Purificação

Tratamentos finais
 Processamento Ascendente

Influência das etapas da linha ascendente sobre

o processo de recuperação do produto
Estágios de
Adaptação Preparação Processo
Seleção MO pré-fermenta
MO de inóculo fermentativo
ção

Estabilidade Produção de
Característica
dos
Localização do produto metabólitos
microrganismos do produto dentro das secundários
células ou impurezas
 Separação e purificação de bioprodutos

Etapa complexa

Características do meio
influenciam

São processos desafiadores

 Não existe um
procedimento único
de recuperação de
produto

Cada processo apresenta suas

peculiaridades devido às características
específicas dos diferentes produtos e
dos microrganismos.
 Operações envolvidas no processo de recuperação de
bioprodutos
Filtração convencional Tamanho das partículas

Centrifugação Tamanho e densidade das partículas

Clarificação
Filtração tangencial (Membranas) Tamanho das partículas

Floculação Hidrofobicidade de partículas

Homogeneização Cisalhamento

Ultra-som Cisalhamento
Rompimento
celular
Moagem em moinho de bolas Cisalhamento

Rompimento químico ou enzimático Hidrólise, solubilização ou desidratação

de moléculas que compõem a parede ou
a Membrana Celular
 Precipitação Solubilidade

Ultrafiltração (membranas) Massa molar e raio hidrodinâmico de

moléculas
Purificação de Extração em sistemas de duas fases
baixa Solubilidade, massa molecular
líquidas
resolução
Cromatografia de troca-iônica Tipo e densidade da biomolécula

Cromatografia de afinidade Sítios específicos (adsorção)

Purificação de Cromatografia de imunoafinidade Sítios específicos (antigeno/anticorpo)

alta resolução Cromatografia de interação hidrofóbica Hidrofobicidade
Cromatografia de exclusão molecular Massa molar

Membranas adsortivas Massa molar e sítios específicos

Cristalização Solubilidade e Características de

equilíbrio líquido-sólido
Tratamentos
Liofilização Características de equilíbrio
finais sólido-vapor
Características de equilíbrio
Secagem líquido-vapor
 Clarificação
Separação das células suspensas de um meio fermentado

Operações unitárias viáveis em escala industrial:

• Filtração convencional
• Filtração tangencial
• Centrifugação

A operação unitária adequada depende da faixa de dimensão da

partícula a ser removida:
 Clarificação
Separação das células suspensas no meio fermentado

Filtração

Aplica-se à clarificação de grandes volumes

Realizada em condições não assépticas

Aplicado principalmente para fungos filamentosos: micélio com

densidade muito baixa
 Clarificação

Filtração Convencional

Aplica-se à clarificação
de grandes volumes de
suspensões diluídas de
células, produtos
extracelulares e
situações que não
necessitam de assepsia.
 Princípio de separação Filtração: tamanho da
partícula
(também forma e compressibilidade do material)

o A suspensão, sob pressão, é perpendicularmente direcionada a

um meio filtrante (filtração convencional).
o Aplica-se a suspensões diluídas de células.
o “A fração volumétrica que atravessa o meio filtrante é
denominada filtrado e o depósito de sólidos (sobretudo células)
sobre o meio filtrante chama-se torta.”

o Alguns tipos de filtro:

1. Rotatório (mais adequado para meios biológicos, pois não é afetado
pela compressibilidade da torta)
2. De pressão
3. Folha (disco) horizontal
 Clarificação
Filtração Convencional

Equipamento utilizado:
Filtro Rotativo a Vácuo (FRV)

• O tambor fica parcialmente submerso

• Tambor oco e rotativo (1 rpm),
coberto com uma malha metálica
filtrante, recoberta com terra
diatomácea.
• Capacidade de 0,1 a 0,2 m3/h
em um recipiente que contém a
suspensão.
• Ocorre leve agitação para evitar a
sedimentação.
• Suspensão é alimentada pela parte
externa do tambor.
• A redução de pressão (vácuo), ocorre
no interior do tambor, promovendo a
filtração (formação da torta).
Esquema de um Filtro de Pressão
Fatores que influenciam a velocidade
de filtração
- permeabilidade de leito (K)
- área de filtração (A)
- viscosidade do líquido (μ)
- espessura do leito (L)
- resistência do leito de filtração (L/K)
- compressibilidade da torta (S)
- concentração celular do líquido (X)
- diferença de pressão através do leito (ΔP)
- const. relacionada a tamanho e forma das células (α’)
 O tempo (t) necessário para a filtração de um volume V de
suspensão contendo células sujeitas à compressibilidade, sob
uma determinada pressão e através de uma área A é dado por:

μ . α’ . X V2
t=
2 . ΔP(1-S) A2

Obs.: - S varia de 0 a 1,0

- Tortas de células microbianas podem ter S de até 0,8
- Para tortas rígidas, S = 0
 Clarificação

Filtração Tangencial

A tensão de cisalhamento do
fluído minimiza o acúmulo de
células e seus fragmentos na
superfície das membranas.

O fluxo de filtrado e o coeficiente

de retenção de solutos ou sólidos
são influenciados pela formação
de um gradiente de concentração
de células ou solutos próximos à
Fluidos de alimentação
superfície da membrana e pelo
escoam tangencialmente à
fouling
superfície filtrante.

Os fenômenos de polarização da concentração e de fouling podem ser

controlados (amenizados) pela alteração das condições de operação do
processo, como velocidade de escoamento e pressão.
 Clarificação

Filtração Tangencial

Membrana de fibra oca

• Possuem elevada área

filtrante por unidade de
filtro.
• Bastante susceptíveis à
entupimentos.

Membrana tipo placa e

quadro

• Possuem pequenas áreas

filtrantes por unidade de
volume.
• Podem ser aplicados em
regime turbulento.
 Clarificação
Centrifugação

A centrifugação de meios fermentados é uma tecnologia já consolidada. Suas

vantagens sobre o processo de filtração são:

Processo completamente contínuo;

Curto tempo de residência;

Equipamento esterilizável por vapor;

Limpeza e operação completamente automatizadas;

Processamento do produto em condições assépticas;

Processamento de microrganismos perigosos em sistema fechado;

Inexistência de custos com auxiliares de filtração, membranas e produtos químicos.

 Clarificação

Centrifugação

Princípio de separação: diferença de densidade (também tamanho de

partícula e viscosidade)

p o
tem

Método que acelera o processo de sedimentação por ação de um campo

gravitacional centrífugo

Baseia-se na diferença de densidade entre a célula e o meio líquido, na

viscosidade do meio líquido, na força motriz e no diâmetro da partícula.
Alguns tipos de centrífuga

a) Tubular; b) Câmara; c) Disco; d) Rolo

Clarificação

Centrifuga tubular

• Podem operar sob refrigeração

(13.000 a 17.000 x g)
• Capacidade limitada de volume

Aplica-se em suspensões de no
máximo 30 g/L de células
Centrífuga
tubular de alta
velocidade
 Clarificação
Centrifuga de disco

Aplica-se em suspensões de no
máximo 250 g/L de células

• Atuam em valores menores de

centrifugação (5.000 a 15.000 x g)
• Permite processamento contínuo
de, por exemplo, 200 m3/h
• Discos aumentam a área de
sedimentação e reduzem o tempo
necessário para centrifugação
https://www.youtube.com/watch?v=dxTT_bP6IwI
Centrífuga de rolo (decanter)

https://www.youtube.com/watch?v=FhS5vN4r5LA
 Fatores de aceleração das centrífugas mais comuns

Ultracentrífugas 105 – 106 x g

Centrífugas tubulares 13000 – 17000 x g
Centrífugas de câmara 6000 - 11000 x g
Centrífugas de disco 5000 - 15000 x g
Centrífugas de rolo 1500 – 4500 x g

Critério para ampliação: Fator de aceleração . tempo ==> ξ. t

Se uma separação satisfatória é atingida com 3000xg

durante 5 minutos, o mesmo resultado pode ser alcançado
com 1500xg e 10 minutos, em escala industrial.
 Obs.: Ultracentrífugas operam descontinuamente e
normalmente têm baixa capacidade de processamento

O fluxo volumétrico de alimentação para uma centrífuga

pode ser determinado pela expressão:

Q = d2 .Δρ . g. ξ. A
18 η
Onde:
Q é o fluxo volumétrico de alimentação
Δρ é a diferença de densidade (dens. Sólido – dens. do líquido)
g é a aceleração da gravidade
d é o diâmetro da partícula
ξ é o fator de aceleração
A é o equivalente de área do rotor
η é a viscosidade dinâmica do líquido
 Exemplo de aplicação para centrífuga
Uma determinada indústria apresenta uma produção de meio
Cálculo de “g”:
fermentado igual a 180 m3/dia. (a) Considerando as características do
meio e da centrífuga a ser empregada, quantas unidades deste
equipamento você solicitaria ao departamento de compras da empresa,
de modo a garantir a separação2 das células do meio de fermentação,
N . R(b) Considere, agora, que foi
sem risco de parar a produção?
g =compradas 8 centrífugas com equivalente de
estabe-lecido que serão
área igual a 0,10 m2. Qual89500
deve ser o fator de aceleração destas
centrífugas?

Dados: Densidade do sólido = 1000 kg/m3

Onde:
3
N é aDensidade do líquido
velocidade = 900 kg/m
ou frequência de rotação do eixo (rpm)
-2
Viscosidade do líquido = 10
R é o raio da circunferência (cm) kg/m.s
Diâmetro da partícula = 0,01 mm
Fator de aceleração = 8000
distância de
Raio:Equivalente entre o centro do eixo
área = 0,10 m2
e o fundo do tubo ou
da câmara de sedimentação
Q = d2 . Δρ . g . ξ . A