Técnicas de inovação e

desenvolvimento de proteínas
obtidas por meio da
biotecnologia
Prof. Dr.a Ana Heloneida de Araújo Morais
PPGNUT/UFRN
 Biotecnologia
Biotecnologia é uma aplicação tecnológica que utiliza
organismos vivos (microrganismos, plantas e animais), ou partes e
derivados, para fabricar ou modificar produtos ou processos para
utilização específica de interesse humano.
Aplicação da Biotecnologia
em alimentos
 Biotecnologia clássica: produção de pães, queijos e
bebidas alcoólicas fermentadas.

 Biotecnologia moderna: produtos desenvolvidos com

base a tecnologia de DNA recombinante (rDNA).
 Técnicas de inovação para
Biotecnologia
 Novidade implantada pelo setor produtivo, por meio de
pesquisas ou investimentos, que aumenta a eficiência do
processo produtivo ou que implica em um novo ou
aprimorado produto.

 Desenvolvimento de novos produtos obtidos por meio de

processos biotecnológicos, visando melhorar a estabilidade,
promover a liberação controlada e aumentar o potencial de
aplicação.
 Como: enzimas, antígenos, açúcares, antibióticos, células,
fragmentos celulares, ácidos orgânicos,
polissacarídeos, hormônios, aminoácidos, peptídeos e prot
eínas.
 Proteínas e peptídeos

• Peptídeos obtidos de proteínas alimentares aparecem como

candidatos promissores a novas opções terapêuticas.

• A fim de controlar doenças crônicas, utilizam-se frequentemente

fármacos, que muitas vezes possuem efeitos colaterais indesejáveis.

• Estudos envolvendo peptídeos oriundos de proteínas alimentares têm

mostrado diversas bioatividades desses nutrientes, tais como:
• atividades anti-microbiana, anti-oxidante, anti-hipertensiva,
anti-obesidade, anti-inflamatória, anti-trombótica.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25623084/
 Descoberta com potenciais para
aplicações biotecnológicas
Os peptídeos apresentam potencial biotecnológico para
aplicação nas indústrias alimentícia e de nutracêuticos.
 Técnicas utilizadas na
Biotecnologia
 Bioprocessos [fermentação, reatores enzimáticos,
separação e purificação de biomoléculas (DSP)],
 DNA/RNA (genômica, farmacogenômica, engenharia
genética, etc.);
 Proteômica,
 Isolamento e purificação de proteínas,
 Engenharia de tecidos,
 Vetores genéticos,
 Bioinformática,
 Nanobiotecnologia.
 Processos de purificação
 A diversidade e crescente importância apresentada pelos
produtos biotecnológicos incentivou o desenvolvimento de
vários processos de purificação.

 Os produtos da indústria biotecnológicas são altamente

diversificados e como resultado dessa diversidade, não há
processos de purificação de aplicação geral.

 O processo pode ser dividido em quatro etapas principais:

 Clarificação
 Concentração e/ ou purificação de baixa resolução
 Purificação de alta resolução
Separação de células e seus
fragmentos do meio de cultivo
(Clarificação)
 Filtração convencional; centrifugação; filtração
tangencial (peso molecular e a sua dimensão);
floculação (formação de partículas maiores).

 Rompimento de células: Homogeneização;

 Moagem em moinho de bolas (moagem fina e

remoagem);

 Rompimento químico ou enzimático.

Filtração tangencial Moagem em moinho de bolas

Floculação
 Concentração e/ ou purificação de
baixa resolução
 Precipitação;
 adição de sais (Precipitação salina)
 adição de solventes
 variação de pH (Precipitação isoelétrica)

 Ultrafiltração (Macromoléculas e vírus);

 separação por membranas em que a força motriz é a
diferença de pressão através da membrana e os poros
da membrana
 Extração em sistemas de duas fases liquidas (Aquosos
bifásicos).

Equilíbrio de partição entre água e um

líquido orgânico genérico ou entre as
duas fases aquosas
 Purificação de alta resolução

 Cromatografia de troca iônica;

 Cromatografia de afinidade (biológica ou química);
 Cromatografia de fase reversa;
 Cromatografia de exclusão molecular.
Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em
duas categorias:
Métodos baseados em características físico-químicas:

1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise,

gel-filtração)
2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica,
eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em
papel, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a

interação entre duas moléculas:

4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das

moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção,
disponível comercialmente)
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Que características devem ter as resina cromatográficas para
possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes
propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros

Cromatografia de troca iônica:

separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente

Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):

separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem caráter hidrofóbico

Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Uma coluna é um tubo cilíndrico aberto nas duas extremidades e preenchido com a
resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com
líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que
estão sendo analisadas.
Tempo zero Tempo 1 Tempo 2 Tempo n
Amostra com
diferentes Líquido
componentes Componentes da que sae
Mais tampão é
amostra se da coluna
colocado na
Resina separam e saem é
coluna,
embebida da coluna com recolhido
forçando os
em diferentes em tubos
componentes
tampão volumes de de um
da amostra a
tampão coletor de
interagirem
frações
com a resina

Os componentes da mistura são

separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como: Coletor de
frações

Concentração
• massa molecular Um cromatograma, como o
• carga elétrica gráfico ao lado, é a maneira
• solubilidade usual de se representar o
• afinidade resultado de uma
cromatografia. Tempo ou volume
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Tipos de Resina de Gel-Filtração
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme
o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas indica quais os tamanhos das
partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO fracionados. Acima ou abaixo
(kD) da faixa, não há separação.
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70 Moléculas pequenas
Sephadex G-25 Dextrana 1-5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150 Proteínas
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600

Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Moléculas pequenas

Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1-6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100 Proteínas
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400

Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000

Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Células, partículas sub-celulares
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000

*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Tipos de Resina de troca iônica
NOME
Tipos de Resina
TIPO
de troca Iônica
GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2N+(CH3) 3 Troca aniônica
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH 2CH 2N+(C2H 5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
Q-Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração
−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3
básico e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
SP-Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração
—CH2-SO3-
ácido e troca iônica de proteínas
básicas e neutras

* Dowex: Dow Chemical Co.; Sepharose e Source: GE LifeSciences Bio

- Gel: Bio Rad Laboratories

Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Cromatografia de afinidade
Um dos métodos mais
Ex: cromatografia de tripsina
eficientes para a
Adsorção
purificação de Mistura de proteínas
proteínas, Eluição
possibilitando um alto Partículas de Lavagem pH 2,0 ou sal
rendimento com gel recobertas
de tripsina
número reduzido de
etapas.
A separação de
moléculas tem como
base a interação
Complexo
específica do analito Inibidor de
tripsina inibdor-
(molécula-alvo) com Coluna
interage tripsina é
empacotada
um ligante imobilizado com esse gel apenas desfeito
na matriz. Forças com a
envolvidas nessa proteína A

interação podem ser Desprezar

proteínas não Inibidor puro
não covalentes retidas -
(eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
H) ou covalentes (p.e., ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
ponte dissulfeto). por competição com o ligante livre
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Preparo da resina de afinidade:
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
Passo 1. Ativação da resina
Reagente Alvo no ligante
(brometo de cianogênio)

Passo 2. Acoplar
o ligante
(tripsina)

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento

estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligação à resina.

A introdução de um braço espaçador diminui esse risco.

Braço espaçador covalente entre
a resina e o ligante

Molécula-alvo (analito)
ligante

Ligação reversível não covalente

 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:

Ligante grupo-específico Especificidade

Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases, hormônios, receptores
estoróides, etc

Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos de His expostos

 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia
abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias.

Característica diferencial da cromatografia convencional:

• partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns)
• aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas
de resina em um mesmo volume da coluna
• fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC

Detector
Controle e
análise dos Duas bombas permitem eluição em gradiente
dados

Detector: índice de refração, absorbância UV

ou Vis, fluorescência, etc.

Coluna pode ser aquecida para melhorar a

Coletor de
eluição diferencial na fase reversa
frações
Coluna e
bombas Injetor de
forno
amostra
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi
eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de
purificação de uma proteína:

- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida

através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.

- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína

de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).

- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de

partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser processadas
as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).

Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às

diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de
interesse.
 Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
Purificação da Glicoquinase hepática de Rato
Etapa Atividade Específicab Rendimentoc Índiceb
( U.mg
U . -1- ) a (%) Purificação
Marcha A: somente cromatografias convencionais
1. Sobrenadantede pâncreas 0.17 100 1
2. (NH4)2 SO4, precipitado 25-55% 2.0 85 12
3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0, eluição KCl 23 45 140
4. troca iônica, colunaCM-cellulose, pH 5.5, eluiçãoNaCl 44 33 260
6. interação hidrofóbica, colunaButyl~Sepharose 80 15 480
7. gel-filtração, colunaSephacrylS-300 130 15 780
Marcha B: com cromatografia de afinidade
1. Sobrenadantede pâncreas 0.09 100 1
2. troca iônica, coluna DEAE
- Sephadex, pH 7.0, eluição KCl 18 84 195
3. Afinidade cromatográfica (benzamidina~agarose ) 420 83 4.500

a U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas
b Atividade específica : medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína

c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação

d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.
Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
 Métodos de Eletroforese

CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)

persulfate

polyacrylamide

cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

• 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas
•Gradiente de acrilamida – aumenta poder de
resolução
 SDS (dodecil sulfato de sódio

C +
A B 2-mercaptoetanol

C
Efeitos do SDS
A B
•desnaturação uniformiza a forma
das proteínas;

B •mascara a carga natural das

C proteínas no pH da corrida, fazendo
com que todas moléculas migrem
para o anôdo;

A •facilita o efeito de redutores

 Determinação da massa
molecular de proteínas
Mobilidade relativa =

distância percorrida pela banda

(migração individual) X distância
Massa molecular (kD)

percorrida pelo marcador da corrida

(migração total)
97.4
(-)
87.0

45.0

29.0

21.0
12.5
Mobilidade relativa (Rf) (+) 6.5
Métodos de Isolamento de
Biomoléculas
 Métodos de Identificação
de Biomoléculas
Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de
uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos
atualmente mais utilizados:

a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com

fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.

b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos

correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.

Sequenciadores automatizados fazem

todas as etapas, com capacidade para
realizar 30 ciclos por dia, a partir de
100-200 picomoles de proteína.
 Métodos de Identificação
de Biomoléculas
Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não
é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.
Proteína
Total 150 a.a
30 aa

sequência obtida a partir da proteína intacta

Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários

peptídeos da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até
haver sobreposição de suas sequências.

proteína
inteira

peptídeos
método A

peptídeos
método B

Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A)

enzimas proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina
(quebra em resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em
Met); e outros.
Métodos de Identificação
de Biomoléculas
1. A espectrometria de massa é baseada na digestão da proteína a
ser identificada por uma enzima proteolítica (por exemplo, a
tripsina) produzindo peptídeos.

2. As massas desses peptídeos são então determinadas com grande

acuidade (0,1-0,5 Da).

3. As massas obtidas formam uma espécie de impressão digital (PMF:

peptide mass fingerprinting) da proteína.

4. Softwares especiais permitem comparar o PMF da proteína que se

quer identificar com os gerados teoricamente para todas as
sequências de proteínas presentes nos bancos de dados.
 Métodos de Identificação
de Biomoléculas
 A espectrometria de massas também pode ser usada para
sequenciar pequenas regiões de peptídeos (por MS/MS).
 O uso das pequenas sequências obtidas em conjunto com as
informações de massas moleculares constitui uma poderosa
técnica de identificação de proteínas.

Espectrômetro de massa ion trap - LCQ Fleet Espectrômetro de massa triploquadrupolo - TSQ 8000 Evo
Bioinformática

 Como avaliar todos esses resultados ? Bioinformática.

 A Bioinformática é um campo interdisciplinar que combina

conhecimentos de diversas áreas, como a ciência da
computação, a estatística, a biologia e a química, entre outras.
 São necessários grandes bancos de dados para analisar
e interpretar dados biológicos.
 Utiliza-se software específicos e os dados são analisados
por ferramentas estatísticas
 Os grandes projetos nessas áreas são realizados por
diferentes grupos de pesquisa que trabalham em
conjunto e, muitas vezes, esses grupos estão localizados,
não apenas, em cidades diferentes, mas, em países
http://www.seer.ufu.br/index.php/biosciencejournal/article/view/7146
diferentes.
http://www.seer.ufu.br/index.php/biosciencejournal/article/view/7146