Laboratório B1-MIA – Componente B1

Trabalho 1 – Cromatografia de exclusão molecular. Troca de tampão de

uma solução de proteína

1.1. Introdução à cromatografia de exclusão molecular

Cromatografia – técnica de separação de componentes de uma amostra pela sua distribuição

entre uma fase móvel e uma fase estacionária.

Cromatografia de exclusão molecular (Size Exclusion Chromatography – SEC, também

conhecida por cromatografia de filtração em gel) – técnica muito usada na análise e purificação
de proteínas e de outras macromoléculas. Consiste na separação dos constituintes de uma
solução por efeito crivo – as moléculas são separadas em função das suas dimensões (do seu
volume hidrodinâmico), uma vez que a fase estacionária (matriz ou resina) tem poros que
permitem ou dificultam a entrada das moléculas a separar. Assim, as moléculas de menor
tamanho ficam retidas nos poros e percorrem um percurso maior, sendo as maiores as
primeiras a sair.

Em condições ideais é o volume hidrodinâmico que determina o fracionamento das moléculas,

não havendo qualquer interação de outra ordem com a matriz.

A cromatografia de exclusão molecular é realizada em coluna, na qual há a considerar:

i) Fase estacionária – a matriz do gel.

ii) Fase líquida móvel – usualmente aquosa, contida nos poros da matriz e no volume
circundante exterior ao gel.

O gel é empacotado de modo a formar um leito de separação e apresenta poros numa gama de
tamanhos bem definida. A solução-amostra contendo as moléculas a separar é aplicada no
topo da coluna; assim que a amostra entra completamente no gel faz-se passar um fluxo
contínuo de eluente.

Podem-se observar 3 situações:

1. As moléculas que são mais pequenas que os poros do gel podem penetrar em todos os
poros.
2. As moléculas com dimensão (volume molecular) idêntica à dos poros, penetram mais
dificilmente nos poros.
3. As moléculas maiores que os poros não penetram no gel, ficando confinadas à fase móvel
e são as primeiras a ser eluídas.

Assim, moléculas pequenas penetram nos poros da fase estacionária enquanto moléculas
grandes são excluídas. Os solutos eluem da coluna por ordem decrescente do seu tamanho –
as moléculas maiores primeiro, seguidas das mais pequenas. As moléculas maiores que os
poros são eluídas todas ao mesmo tempo, independentemente do seu tamanho; assim, se se
quiser separar moléculas de 100 e 200 kDa, por exemplo, não se pode usar um gel com poros
de 50-75 kDa porque as moléculas não os vão conseguir atravessar, sendo eluídas todas ao
mesmo tempo.

O peso molecular (PM) da molécula mais pequena que não entra nos poros de um gel permite
definir o limite de exclusão do gel (LE). O volume total de uma coluna de gel (VT) é a soma do
volume da matriz de gel (Vg), do volume de eluente dentro das partículas de gel (Vi) e do
volume de eluente fora das partículas de gel (Vo).

VT = Vg + Vi + Vo

Vo é conhecido por volume morto e é igual ao volume de eluição de moléculas que são
completamente excluídas das partículas de gel, por serem maiores que os poros maiores (PM
> LE).

O volume de eluição de um soluto, Ve , é o volume de eluente necessário para eluir esse soluto
da coluna, a partir do momento em que ele entra em contacto com o gel.

Ve = Vo + Kd Vi

Kd é o coeficiente de distribuição (entre a fase estacionária e a fase móvel) e representa a

fração de Vi que é acessível a um dado soluto. É independente da geometria da coluna e
depende, para um dado gel, do tamanho e forma das moléculas do soluto.

Da equação anterior vem:

Kd = (Ve – Vo) / Vi

⮚ Se o soluto é completamente excluído do gel (PM = LE), Kd = 0 e Ve = Vo – o soluto é eluído

no volume morto.
 ⮚ Se o soluto tem acesso a todos os poros, Kd = 1 e Ve = Vo + Vi.

Kd está compreendido entre 0 e 1 e, num determinado gel, é tanto maior, quanto menor for o
Em condições
ideais apenas peso molecular do soluto. Se Kd >1, houve adsorção do soluto ao gel, provocada por exemplo
o volume
hidrodinâmico por interações iónicas. O comportamento de um determinado soluto num dado gel pode ser
afeta o expresso pelo volume de eluição relativo (Vr = Ve / Vo), que é independente da coluna usada.
fracionamento
das moléculas

A cromatografia de exclusão molecular, para além de permitir separar moléculas de interesse

de outras que tenham caraterísticas (tamanho) muito diferentes, pode ser usada para mudar o
tampão ou para retirar o sal de uma amostra, como por exemplo, a remoção de sal em
amostras contendo proteínas precipitadas por salting-out. A cromatografia de exclusão
molecular também pode ser usada para determinar parâmetros como o raio hidrodinâmico e o
peso molecular, conseguido usando moléculas de peso molecular bem conhecido e traçando
uma curva de calibração.
PM = LE
i) Troca de tampão – As moléculas do sal têm acesso a todos os poros (Kd = 1) e as
macromoléculas são excluídas (Kd = 0). Há assim uma boa separação entre o sal e a
proteína, e a proteína elui arrastada pelo eluente, o novo tampão.
ii) Dessalinização de soluções de macromoléculas – Equivalente ao caso i) mas com a água
com eluente (ou outro solvente, não salino).
iii) Separação de misturas contendo várias macromoléculas de diferentes pesos moleculares
– Moléculas de diferentes tamanhos entram em menos ou mais poros percorrendo assim
trajetos menores ou maiores até atingirem a base da coluna (0 ≤ Kd = 1).
iv) Determinação do peso molecular de macromoléculas – Para a calibração usa-se um
conjunto de macromoléculas de peso molecular conhecido. Há uma relação linear entre o
volume de eluição relativo (Ve / Vo) de uma substância e o logaritmo do seu peso
molecular. Comportamento de um soluto num gel

1.2. Parâmetros que condicionam o processo cromatográfico

aka boa capacidade de separação
Para se conseguir uma boa resolução cromatográfica (a resolução de uma coluna mede a sua
capacidade de separação) é fundamental ter em conta o tipo de gel (matriz), o eluente, o
comprimento da coluna, o volume da amostra e a qualidade de enchimento da coluna.
O comprimento da coluna é proporcional à resolução
cromatográfica e ao tempo da eluição ; a amostra
não pode ser muito viscosa visto que causa
instabilidade dinâmica e o volume da coluna
influencia a sua capacidade de carga e é escolhido
de acordo com o volume de amostra
i) Amostra: O volume de amostra condiciona a escolha das dimensões da coluna a utilizar. A
viscosidade da amostra não deve ser demasiado elevada para não provocar problemas de
instabilidade hidrodinâmica.
ii) Coluna: O modo como o gel é empacotado é determinante para o adequado
funcionamento de uma coluna de exclusão molecular. O empacotamento deve ser regular,
Escolha do eluente :
- Não interferir no de modo que a densidade do gel seja homogénea e a que não se observem bolhas de ar
processo de
separação tendo em na coluna. O comprimento da coluna de gel (l) afeta a resolução cromatográfica, que é
conta a escolha de
pH e a não proporcional a (l), assim como o tempo de eluição. O volume da coluna está relacionado
ocorrência de
precipitações ( pois com a sua capacidade de carga e é escolhido de acordo com o volume de amostra.
precipitação
indesejada dos iii) Eluente: A composição do eluente deve ser escolhida de modo a não interferir no
componentes da
amostra = bloqueio processo de separação. Há que ter cuidado com a escolha do pH, de modo a garantir que
irreversível ;
- Manter força i) se mantenha a estabilidade e a atividade biológica dos componentes da amostra e ii)
iónica por volta de
0,15 mol/L para que não ocorram precipitações. A precipitação dos componentes da amostra na coluna
evitar interações
iónicas entre solutos pode provocar um bloqueio irreversível. Além disso, para evitar interações iónicas
e matriz
(indesejáveis) entre os solutos e a matriz do gel, a força iónica é em geral mantida a cerca
de 0,15 mol/L.
iv) Escolha do gel: O gel de Sephadex tipo G usado é constituído por dextrana (um
polissacarídeo de α-D-glucose em ligação 1,6, de elevado peso molecular) entrecruzado
com epicloro-hidrina, de modo a formar uma rede tridimensional. Há assim vários géis
com diferentes gamas de fracionamento dependendo pelo peso molecular da dextrana e
da quantidade de epicloro-hidrina usados. A escolha do tipo de Sephadex é feita em
função do tamanho das moléculas a separar.

✔ Por exemplo, considerando os analitos objeto de estudo do presente trabalho

laboratorial (hemoglobina e fosfato de sódio), sabe-se que se se usar o gel Sephadex

G-75, a hemoglobina, de peso molecular 64500 Da, entrará em alguns poros e não
entrará noutros (0 < Kd< 1). Se se usar Sephadex G-10, G-15, G-25 ou G-50, a
hemoglobina será completamente excluída (Kd =0 logo Ve = Vo) enquanto o fosfato
de sódio pode entrar em todos os poros (Kd = 1).

1.3. Condutimetria

Quando se aplica uma diferença de potencial entre dois elétrodos imersos numa solução de
um eletrólito, os iões dissolvidos migram para os elétrodos: os catiões migram para o elétrodo
negativo e os aniões para o elétrodo positivo. Esta migração de iões constitui o fluxo de
corrente elétrica através da solução. A condutividade elétrica de uma solução depende da
concentração e da natureza das várias espécies iónicas presentes. Por exemplo, uma solução de
fosfato de sódio 1 mol/L conduz melhor a corrente elétrica – tem maior condutividade – que
uma solução 0,1 mol/L em fosfato de sódio, pois a solução mais concentrada contém um maior
número de iões por unidade de volume.

Para medir a condutividade elétrica de uma solução mergulha-se nela uma célula
condutimétrica, que consiste em dois elétrodos de um metal inerte, em geral platina, de igual
tamanho e forma, colocados paralelamente um ao outro. Nestas condições, entre os dois
elétrodos fica uma coluna de líquido e a resistência elétrica (R) será função das dimensões
dessa coluna, da natureza da solução e da temperatura. A resistência de uma coluna de solução
de secção transversal uniforme, com área A (cm2), entre dois elétrodos distanciados de d (cm) é
dada por:

R= ρ*d/A

A constante de proporcionalidade (ρ) é a resistência específica ou resistividade. À grandeza d/A

chama-se constante da célula.

A condutividade, L, é o inverso da resistência e é expressa em ohm-1 (ou siemens, S).

L = 1/R = 1/ ρ * A/d = K * A/d

K é o inverso da resistência específica e denomina-se condutividade específica; é função da

concentração, Ci, de cada ião e da condutividade equivalente (λi), uma constante característica
de cada ião que depende da sua carga, tamanho e velocidade. A condutividade específica é
proporcional a ∑ Ci λi,. A condutividade específica da água pura é 5*10-8 ohm-1 cm-1. Quando se
mede a condutividade de uma solução com um sal, é expectável que a condutividade seja mais
elevada nas frações que contêm o sal.

Trabalho prático

Neste trabalho prático pretendeu-se efetuar uma troca de tampão de uma solução de proteína.
Assim, parte-se de uma solução de hemoglobina em tampão fosfato e pretende-se obtê-la
dissolvida em solução de tampão Tris (tris-hidroximetilaminometano)-HCl (pH 8,5). Como as
moléculas de hemoglobina (64500 Da) são bastante maiores que as de fosfato de sódio (164
g/mol = 164 Da), a cromatografia de exclusão molecular é muito eficiente na troca de tampão
da solução de hemoglobina.
⮚ O gel utilizado deve ter um limite de exclusão inferior a 64500 Da, porque assim a proteína

é completamente excluída e elui mais rapidamente do que se se usar uma matriz para a
qual Kd > 0. As moléculas de fosfato de sódio, muito mais pequenas, entram nos poros e
são retardadas em relação às de proteína. Assim, consegue-se trocar o solvente fosfato
por Tris-HCl usando um gel de Sephadex G- 50, uma vez que apenas moléculas com 1,5 –
30 kDa conseguem entrar nos poros.

⮚ Qualquer proteína com mais de 30 kDa passam por fora das esferas no gel de Sephadex

G-50; assim, não se conseguiriam separar proteínas de 50 e 100 kDa. Se se considerar o

gráfico obtido para o fosfato e para a hemoglobina para esta nova mistura, o pico da
hemoglobina vai corresponder ao volume de exclusão, ou seja, as duas proteínas (50 e
100 kDa) apareceriam no pico da hemoglobina (não seria antes desse porque são
completamente excluídos como a hemoglobina). Se houver uma proteína com 20 kDa o
seu pico vai aparecer entre os picos da hemoglobina e do fosfato, uma vez que a proteína
entraria em alguns poros e não entrariam noutros.

Cromatograma – diagrama de eluição que permite expressar os resultados de uma

cromatografia de exclusão molecular. No eixo das abcissas é representado o tempo ou volume
de eluição e no das ordenadas a intensidade do sinal associado aos componentes da amostra
(como absorvência e condutividade).

Notas relativas ao procedimento

Preparação do gel – O Sephadex é fornecido em forma de pó seco e deve ser posto a hidratar
em excesso de solvente, devendo evitar-se agitação excessiva e o uso de agitadores magnéticos
para não danificar o gel. Obtém-se uma suspensão relativamente compacta, mas ligeiramente
fluida, que deve ser agitada sem vareta para não danificar os poros.

Empacotamento da coluna – A suspensão de gel deve ser adicionada toda de uma vez ao
longo das paredes da coluna, com ajuda de uma vareta, e o eluente deve ser recolhido para um
copo. Deve ser adicionado eluente com uma pipeta Pasteur, de modo a manter sempre uma
coluna de líquido sobre o gel (NUNCA DEIXAR SECAR O TOPO DA COLUNA).

Acondicionamento da coluna – Em todo o leito, a fase móvel deve ser o eluente. Assim,
deve-se fazer passar em contínuo um volume de eluente equivalente a 2 ou 3 volumes da
coluna. Deve-se recolher a fração de eluente que passou pela coluna e ler a sua condutividade
e Abs 540 nm. Estes valores darão indicação sobre o momento em que deve ser terminada a
cromatografia, (em que já foram eluídos completamente a proteína e o fosfato).

Aplicação da amostra e eluição – Depois de se recolher 3 tubos de eluente usa-se uma

micropipeta para aplicar 0,4 mL de solução de hemoglobina, aplicando a amostra ao longo das
paredes e distribuindo-a uniformemente por toda a secção. Quando toda a amostra entrar
completamente no leito, deve-se adicionar suavemente eluente de modo a deixar uma coluna
de líquido - até ao topo da coluna, para evitar turbulência no leito do gel. Eluir até um volume
10 mL superior ao volume da coluna ou até se obter valores de condutividade e Abs 540 nm
iguais aos valores iniciais de referência.

Análise das frações de eluato – Ler a condutividade e guardar cada fração outra vez no mesmo
tubo. Após cada medição, mergulhar a célula condutimétrica num copo com água destilada até
a condutividade baixar até < 50 µS e secar ligeiramente com papel absorvente. Ler a
absorvência a 540 nm, contra o eluente (branco). Guardar cada fração outra vez no mesmo
tubo. Após cada medição, lavar a célula com água destilada e secar ligeiramente com papel
absorvente.

Como foram preenchidos 15 cm da coluna de cromatografia com o gel de Sephadex G-50, e

considerando um diâmetro da coluna de cromatografia de 1 cm, determinou-se o volume
necessário eluir para efetuar o seu acondicionamento (volume de eluente a ser aplicado antes
2 2
da adição da hemoglobina): 𝑉 = π * 𝑟 * ℎ = π * (0, 5) * 15 = 11, 78 𝑚𝐿

⮚ As proteínas podem ser detetadas em solução recorrendo a espetrofotometria no UV, uma

vez que possuem aminoácidos como a tirosina e o triptofano cujos anéis aromáticos
absorvem radiação com comprimentos de onda na zona do ultravioleta. A hemoglobina é
uma proteína constituída por quatro grupos heme que contém um centro metálico com
um átomo de ferro. Este metal confere à hemoglobina uma tonalidade
castanha-avermelhada, o que torna possível a sua deteção utilizando espetrofotómetros
na zona do visível. Como as cuvetes de plástico não absorvem radiação ao comprimento
de onda de 540 nm, estas podem ser utilizadas para detetar a presença de hemoglobina
sem provocar interferências nos resultados observados.
⮚ A hemoglobina estava inicialmente dissolvida em tampão de fosfato de sódio. O fosfato de
sódio, sendo um sal, é um bom condutor de corrente elétrica, o que possibilitou a sua
deteção nas frações de eluato através da medição da condutividade das amostras.
O comprimento da coluna de gel afeta a resolução cromatográfica, na medida em que quanto
maior for o comprimento da coluna maior será a resolução do cromatograma (mais distantes
estarão os picos e consequentemente mais separados estarão os componentes da solução).
Assim, pode-se afirmar que existiu uma separação eficiente da hemoglobina e do fosfato pela
utilização do gel de Sephadex G-50, uma vez que os dois picos correspondentes à eluição
destes compostos são bem visíveis e não se sobrepõem. No entanto, se se pretendesse um
cromatograma ainda mais bem definido, poder-se-ia aumentar o comprimento da coluna de
cromatografia (e consequentemente da coluna de gel) para se verificar uma melhor separação
da hemoglobina e do fosfato.

Trabalho 2 – Estudo da fermentação alcoólica usando diferentes

substratos

A fermentação é uma via anaeróbica (que não precisa de oxigénio) que permite o catabolismo
da glucose.

Os 10 passos da glicólise terminam com a formação de 2 moléculas de piruvato por cada

molécula de glucose, podendo o piruvato seguir por três vias metabólicas principais: o ciclo do
ácido cítrico (através da formação de acetil-CoA em condições aeróbicas), a fermentação lática
(em condições anaeróbicas, originando lactato) e a fermentação alcoólica (em condições de
hipoxia e condições anaeróbicas, originando etanol e CO2).

Na fermentação, a única via de extração de energia é a glicólise; como o piruvato produzido na

glicólise não continua através do ciclo do ácido cítrico, a cadeia de transporte de eletrões não é
utilizada e o NADH produzido na glicólise não consegue libertar os seus eletrões na cadeia
transportadora de eletrões. Assim, para conseguirem regenerar o transportador de eletrões
reduzido e voltar a ter NAD+ para este poder ser utilizado novamente na glicólise, os
organismos recorrem à fermentação (quer seja lática ou etanólica).

✔ No frigorífico também ocorre fermentação mas é muito mais lenta (os alimentos demoram

mais tempo a estragar-se)

✔ Se se deixar imenso tempo as leveduras em contacto com substratos que supostamente

não conseguem metabolizar pode verificar-se alguma fermentação, não porque as

 enzimas apareceram do nada mas porque podem existir outros organismos nas
proximidades que conseguem metabolizar esses substratos (como o amido) e
disponibilizar resíduos de glucose que a levedura depois pode usar.

Em aplicações biotecnológicas podemos querer que a levedura cresça mas num ambiente
clínico ou na análise alimentar quer-se que a levedura não cresça (diminuindo a temperatura
ou aumentando-a imenso ou então não lhe dando substrato).

Para os substratos poderem ser utilizados pela levedura é necessário que esta tenha as enzimas
necessárias para os metabolizar. Por exemplo, se a levedura não tiver a enzima lactase não
conseguirá metabolizar lactose (obter glucose e galactose), e se não tiver a α-amilase não
conseguirá metabolizar o amido. Por outro lado, se tiver a hexocinase conseguirá metabolizar
substratos como a frutose, a glucose e a manose, que poderão entrar na glicólise e assim
originar piruvato que depois é convertido em etanol e CO2.

Anotações importantes durante o procedimento

⮚ A partir da agitação magnética todos os passos devem ser realizados o mais rapidamente

possível pois mal se adiciona o substrato a enzima começa imediatamente a atuar. Além
disso, é necessária rapidez na execução destes passos para que a quantidade de O2
incorporada seja a menor possível e assim o processo de degradação do piruvato
favorecido seja a fermentação

⮚ Não se deve agitar a velocidade elevada durante mais que 1s para evitar a rutura da

levedura

⮚ Devem ser garantidas condições de anaerobiose – o O2 é indesejado, ou seja, se a mistura

reagir com O2 ainda no copo podem ocorrer outros processos que não a fermentação

⮚ Para que os resultados sejam comparáveis o tempo deve ser aproximadamente o mesmo.

Assim, deve-se registar sempre o tempo exato para cada ensaio

Trabalho prático
 Para poderem ser utilizados como substratos da fermentação alcoólica, os açúcares têm de ser
inicialmente convertidos em intermediários que consigam entrar na glicólise. Se as enzimas
necessárias para a conversão destes substratos não estiverem presentes no meio (ou se
estiverem inativas), estes não conseguem entrar nas vias glicolítica e fermentativa, não
havendo formação de etanol e CO2.

Ora, neste trabalho prático avaliou-se a formação de gás decorrente da atividade fermentativa
da levedura; de modo a poder comparar os resultados obtidos normalizou-se o volume de CO2
à massa de levedura e ao tempo a que cada mistura de substrato e levedura esteve sujeita a
temperatura elevada (VCO2/mlev/t35ºC).

✔ Existe libertação de CO2 em grandes quantidades para os substratos glucose, frutose e

sacarose, o que comprova a presença das enzimas hexocinase e invertase na levedura;

estas enzimas permitem a transformação dos substratos utilizados em intermediários da
glicólise, demonstrando uma elevada atividade fermentativa da levedura para estes
substratos.

✔ Existe uma libertação muito reduzida de CO2 para o substrato maltose. Ora, a maltose é

hidrolisada em resíduos de glucose pela exoglucosidase (glucoamilase), que existe em

pequenas quantidades na levedura (uma vez que se verificou atividade fermentativa
reduzida para este substrato).

✔ As enzimas glicerol cinase e glicerol 3-fosfato desidrogenase (necessárias para o

metabolismo do glicerol) não são enzimas presentes usualmente em S. cerevisiae, pelo

menos em quantidades significativas.

✔ Não se verificou qualquer libertação de CO2 para os substratos galactose, lactose e amido,

o que pode ser explicado pela ausência das enzimas α-amilase, lactase e de todas as
Via de Le Loir enzimas necessárias para converter a galactose em glucose 6-fosfato, impossibilitando a
formação de intermediários que possam entrar na glicólise e assim ser fermentados a
etanol e CO2 pela levedura.

Nota: Uma dissolução incompleta da levedura no substrato diminui o volume de CO2

produzido, uma vez que a existência de agregados de levedura impede que as células que estão
no centro do agregado estejam em contacto com o substrato, diminuindo a atividade
fermentativa das células em solução.

Possíveis razões pelas quais a fermentação não foi muito eficaz:

- Dissolução incompleta da levedura no substrato »» diminuição do volume de CO2 produzido;
- Demasiada pressão no êmbolo da seringa »» não há libertação de CO2 como deveria.
 Nota 2: Outro problema pode resultar de uma seringa cujo êmbolo não esteja bem ajustado.
Se se acumular demasiada pressão na seringa o êmbolo desta não varia como deveria, não
permitindo que se liberte o valor de CO2 que deveria. Este problema pode ser resolvido
tocando na seringa de modo a facilitar a libertação deste volume de gás.

Trabalho 3 – Estudo da fermentação alcoólica usando a levedura

imobilizada
Imobilização da levedura »» função mantida ou melhorada através do aumento
da estabilidade à variação de temperatura ou à presença de inibidores
A imobilização de células consiste na sua retenção num espaço definido em que a sua função
seja mantida ou mesmo melhorada (aumento de estabilidade à temperatura ou a inibidores),
permitindo o seu uso repetido e contínuo. A imobilização pode também aplicar-se a enzimas
ou moléculas como anticorpos.

A imobilização de células permite colher determinados metabolitos produzidos por essas

células sem que estas passem para os efluentes, permitindo uma mais fácil recolha dos
produtos e um melhor manuseamento e controlo das células. Em processos de análise, a
imobilização de enzimas ou outras moléculas específicas, como anticorpos, permite obter
sistemas direcionados para a deteção, identificação e quantificação de analitos específicos
(biossensores).

Existem vários processos de imobilização, sendo um deles a oclusão numa matriz. Neste
processo, as células são envolvidas numa matriz insolúvel. O alginato é um polissacarídeo
constituído por resíduos de ácido β–D-manurónico e ácido α–L-gulurónico em ligação (1→4),
que podem ser contíguos ou dispersos na cadeia do polissacarídeo e lhe conferem carga
negativa. Na presença de soluções aquosas contendo iões cálcio, há a associação de cadeias
por complexação, sendo esta complexação maior quanto maior for a quantidade de resíduos
de GulpA. GulpA - forma piranosídica do ácido alfa-L-gulurónico

✔ O alginato tem a propriedade de gelificar na presença de iões cálcio. Assim, junta-se

alginato de sódio (solúvel em água, onde está solubilizada a levedura) a cloreto de cálcio
(também solúvel), originando alginato de cálcio (insolúvel em água). Quando a gota de
alginato de sódio cai na solução de cloreto de cálcio o seu exterior vai gelificar, o que faz
com que a levedura que está no interior não saia (fica retida na malha formada pelo
alginato de cálcio).

Porque se usa uma solução de CaCl2?

- O alginato é um polissacarídeo com carga negativa devido aos resíduos de
ácido beta-D-manurónico e ácido alfa-L-gulurónico através da complexação,
imobilizando a levedura no suporto de alginato (formam-se umas bolas de
alginato onde está contida a levedura imobilizada).
Notas sobre a agitação :
» Facilta a entrada de
sacarose e a libertação de
CO2 ;
» Provoca a rutura da matriz --
pode desnaturar as enzimas
mecanicamente ⮚ Se as esferas ficarem algum tempo a agitar no cloreto de cálcio o cálcio vai difundir
» Aumenta as áreas de
contacto entre a solução e as
para o seu interior. Se ficar algum tempo na solução, toda a esfera vai ser convertida
esferas, permitindo que os
iões Ca2+ ultrapassem aem alginato de cálcio, havendo uma difusão do sódio para o exterior (o meio exterior é
matriz pororsa de alginato e
entrem em contacto commenos
a concentrado em sódio). Para a levedura realizar fermentação tem de haver
levedura, complexando-a
entrada de sacarose nas esferas e saída de CO2.

⮚ Se houver uma malha maior as moléculas maiores conseguem atravessar (as leveduras

conseguem sair), e se for menor até as moléculas mais pequenas ficam retidas (como o
CO2).

Solução viscosa – líquido que tende a comportar-se como um sólido

Gel – sólido que tende a comportar-se como um líquido

Notas sobre a parte experimental

Como preparar a solução de alginato de sódio: num erlenmeyer contendo 250 mL de água
destilada adicionar 7 g de alginato de sódio, lentamente e sob agitação magnética vigorosa.
Deixar a agitar até total dissolução (que pode ser ajudada com o aquecer da solução).

Questionário
✔ Substrato: O processo de fermentação foi avaliado através da medição do volume de CO2

libertado em função do tempo decorrido. Sabe-se que a levedura possui invertase, a

enzima necessária para metabolizar sacarose em intermediários de glicólise, o que tornou
este dissacarídeo um substrato adequado para o estudo da taxa fermentativa da levedura.

✔ Efeito das lavagens: O segundo ensaio decorreu mais lentamente, denunciando uma

atividade fermentativa menor. Ora, antes de se realizar o segundo ensaio foram efetuadas
duas lavagens com CaCl2 de modo a remover leveduras que pudessem ter saído de esferas
lesadas devido à agitação; assim, como existia uma menor quantidade de levedura
imobilizada de um ensaio para o outro (devido a perdas de S. cerevisiae para a solução),
verificou-se uma diminuição da velocidade da reação de fermentação.

✔ Efeito da temperatura: A atividade fermentativa da levedura foi muito baixa à

temperatura ambiente (19ºC), sendo ligeiramente maior a 30ºC mas ainda

significativamente menor que a atividade fermentativa a 40ºC e a 50ºC. A 50ºC o volume
de CO2 libertado não foi significativamente maior do que a 40ºC, o que evidenciou que a
temperatura ótima de atuação da levedura sobre o substrato utilizado seria próxima dos
40ºC.
✔ Vantagens da agitação: As esferas de alginato começam por gelificar no exterior, que está
em contacto com os iões cálcio; no entanto, para a gelificação ser completa é necessário
que os iões Ca2+ difundam para o interior das esferas. A agitação provoca o aumento da
área de contacto entre a solução e as esferas, permitindo que os iões Ca2+ ultrapassem a
matriz de alginato e complexem com este polissacarídeo, formando-se esferas compactas
em torno da levedura (ocorre oclusão matricial). Além disso, o contacto da levedura com a
sacarose sob agitação facilita a entrada deste dissacarídeo nas esferas, promovendo a
fermentação alcoólica e favorecendo ainda a libertação de CO2 e etanol (uma vez que a
acumulação de produtos inibe a reação no sentido direto). É PRECISO AGITAR

✔ Desvantagens da agitação: A agitação em demasia pode provocar a rutura das ligações

glicosídicas da matriz e a destruição das esferas, havendo libertação de levedura para o

 meio e deixando de se conseguir estudar a atividade fermentativa de levedura imobilizada
(uma vez que esta deixa de estar contida no alginato de cálcio).

✔ Porque usar uma solução com cálcio? O alginato de sódio que foi utilizado no trabalho,

assim como a solução de cloreto de cálcio, são solúveis em água quando isolados. No
entanto, quando o alginato de sódio é adicionado à solução de entrecruzamento (CaCl2),
existe uma complexação entre os catiões (Ca2+) e o alginato de sódio, originando esferas
de alginato de cálcio que são insolúveis em água e nas quais fica contida a levedura. Ora,
depois de as esferas estarem formadas estas poderiam desfazer-se em solução se a
concentração de cálcio fosse menor no exterior das esferas (uma vez que o cálcio sairia
das esferas por difusão); assim, utilizou-se como solução de lavagem uma solução de CaCl2
0,5% que permitiu a manutenção da estrutura das esferas de alginato de cálcio ao mesmo
tempo que removia a levedura não imobilizada.

✔ Permeabilidade da matriz a pequenas moléculas: A matriz de alginato de cálcio é

aparentemente permeável à maioria das moléculas de CO2, uma vez que foi possível medir
o volume de gás libertado decorrente da atividade fermentativa; no entanto, com o
decorrer do trabalho experimental verificou-se que as esferas de alginato se tornaram
menos densas que a solução em que estavam contidas, fenómeno este que pode ser
explicado pela retenção de moléculas de CO2 (de natureza hidrofóbica) na matriz de
alginato de cálcio.

Trabalho 4 – Determinação do perfil de triacilglicerídeos em óleos

alimentares

Os lípidos, juntamente com as proteínas e os hidratos de carbono, são as fontes principais de

energia. Os óleos vegetais representam um dos principais produtos extraídos de plantas, sendo
constituídos principalmente por triacilglicerídeos (>95%) e pequenas quantidades de mono e
diacilglicerídeos, e ácidos gordos livres.

Os óleos vegetais são constituídos maioritariamente por ácidos gordos insaturados (com uma
ou mais insaturações), sendo líquidos à temperatura ambiente, enquanto as gorduras são
sólidas à temperatura ambiente, devido à sua constituição em ácidos gordos saturados. Os
ácidos gordos de origem natural não são ramificados e contêm um número par de átomos de
carbono uma vez que são sintetizados a partir do acetato.

Os FAMEs (fatty acid methyl esters) podem ser obtidos por transesterificação dos
triacilglicerídeos, utilizando diversos reagentes baseados em reações catalisadas por ácido ou
catalisadas por base. Como este método não envolve tratamento térmico, reduz-se o risco de
decomposição dos ácidos gordos.

Os FAME são separados e quantificados por cromatografia em fase gasosa com detetor de
ionização de chama (GC-FID), utilizando o método do padrão interno. A amostra, normalmente
dissolvida num solvente volátil, é injetada utilizando um sistema de injeção que se encontra a
uma temperatura elevada (>200 ºC), que permite vaporizar o solvente e todos os componentes
da amostra. Estes são arrastados pela coluna cromatográfica revestida por uma fase
estacionária através de um gás inerte, normalmente H2. A afinidade dos compostos para a fase
estacionária e para a fase móvel é responsável pela separação dos compostos, fazendo com
que cada um elua da coluna a um tempo diferente (tempo de retenção). Por fim, quando os
compostos chegam ao detetor do tipo FID (composto por uma chama de hidrogénio/ar)
formam-se espécies carregadas eletricamente que produzem um aumento na corrente elétrica
proporcional à quantidade de carbono que passou pela chama. O resultado dessa corrente é
amplificado e transformado pelo software num pico cromatográfico.

Também é possível identificar a presença de ácidos gordos em diferentes amostras recorrendo

à Espetroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), uma técnica que
permite medir as interações da radiação na região do infravermelho do espectro
eletromagnético com a amostra sem a destruir. Os resultados de FTIR são apresentados sob a
forma de um espetro da energia absorvida ou emitida em função da energia, frequência,
comprimento ou número de onda da radiação, estando a região do infravermelho mais
utilizada localizada entre os 4000 e 400 cm-1.

Problema: As principais ligações características dos AG são as ligações C-H (por volta dos 3000
cm-1), cujas vibrações e distensões não permitem distinguir entre os vários ácidos gordos (estão
presentes em todos). Assim, a técnica mais adequada para distinguir os ácidos gordos
metilesterificados é a GC-FID.

✔ Nota: O GC-FID não consegue detetar ácidos gordos livres, têm de estar esterificados com

o metanol.
Triacilgliceróis – constituídos por ácidos gordos esterificados com glicerol. Se os TAG forem
colocados numa solução com metanol (reagente) vão transesterificar. Este processo só
acontece na presença de KOH (catalisador), havendo uma troca do éster e originando ácidos
gordos metilesterificados.

✔ A transesterificação ocorre devido ao deslocar do equilíbrio da reação – como há uma

grande abundância de metanol, que é um dos reagentes, quando comparados com o

glicerol, vai haver um deslocamento do equilíbrio no sentido de consumir metanol e
originar glicerol, formando-se os FAME. A reação é tão espontânea que nem é preciso
aquecer a solução.
✔ Se a densidade for 1, 5 mg de óleo corresponderiam a 5 µL. Como este valor é muito
pequeno, se se fossem medir 5 µL este volume ficaria nas paredes da ponta da
micropipeta. Quando se têm líquidos viscosos não se utilizam volumes mas sim massas
(a não ser que sejam quantidades muito grandes, apesar de ser preferível medir a
massa).

✔ Usa-se apenas 0,1 mL de C17:0 e não 1 mL porque a concentração é 15 mg/mL (tem

menos metanol porque é mais concentrada).

✔ N-hexano – solvente orgânico, muito volátil. Quando se pipeta substâncias voláteis e a

pipeta fica na vertical a pipeta começa a gotejar, devendo por isso aspirar-se e deixar sair o
líquido várias vezes de modo a que a pressão de vapor no interior da pipeta deixe de criar
pressão no líquido que está na ponta. Assim, aspira-se várias vezes para saturar de vapor o
interior da ponta, podendo depois medir-se o volume correto.

⮚ Isto acontece tanto para o n-hexano como para o padrão interno (devido ao metanol),

mas é mais visível para o n-hexano porque o volume deste a ser pipetado é maior,
sendo este líquido orgânico mais volátil do que o metanol.

Notas importantes relativas ao procedimento

⮚ O padrão interno deve ser um analito com alta semelhança em propriedades químicas,

físicas e estruturais ao analito de interesse na amostra. Este padrão é utilizado para

efetuar calibrações, sendo adicionada uma quantidade conhecida do mesmo à solução
 com o analito de interesse. É uma técnica de calibração bastante utilizada quando se
analisam substâncias/analitos em baixas concentrações numa amostra.

✔ O ácido heptadecanoico (C17:0) foi usado como padrão interno devido à sua

semelhança química aos ácidos gordos presentes no óleo; no entanto, como este não é
um ácido gordo natural em plantas (pois possui um número ímpar de carbonos), o
ácido heptadecanoico não vai estar presente na amostra, pelo que não vai aumentar a
área dos picos já existentes e interferir com os resultados obtidos ao ser erradamente
quantificado.

✔ O padrão foi adicionado em metanol pois a grande quantidade de metanol

comparativamente com o glicerol vai deslocar o equilíbrio na direção da reação de

transesterificação, que é a reação pretendida. O padrão interno é o éster metílico do
C17:0.

✔ O n-hexano é muito volátil; assim, se o C17:0 estivesse dissolvido em n-hexano e não

em metanol, de cada vez que se abrisse o frasco onde o padrão interno estava contido
haveria libertação de n-hexano para o meio, o que levava a um aumento de
concentração do padrão interno com o passar do tempo (havia evaporação do
solvente). Assim, iria haver uma menor concentração de ácidos gordos na amostra, não
devido a uma alteração nos óleos mas sim devido a uma evaporação do solvente.

Principais características do padrão interno

✔ Composto que não está presente na amostra

✔ Deve ser estruturalmente semelhante aos compostos que estão a ser analisado para ter

um comportamento semelhante a estes (o padrão interno tem de ser semelhante aos AG

metilesterificados)

✔ Tem de ser estável em relação às altas temperaturas utilizadas na cromatografia (estável

nas condições de análise)

✔ Deve estar numa quantidade semelhante à dos analitos

Graças ao padrão interno podemos quantificar os ácidos gordos em relação à massa de

amostra; senão apenas poderíamos relacionar umas áreas com as outras (áreas relativas).
⮚ O tamanho do pico do padrão interno deve ser semelhante aos picos intermédios do

cromatograma de modo a permitir a quantificação tanto dos picos maiores como dos
picos mais pequenos

⮚ Quando temos uma maior massa de amostra o tamanho do pico do padrão interno vai ser

mais pequeno

⮚ O hidróxido de sódio (KOH) vai servir de catalisador básico na reação de

transesterificação.

⮚ A adição de hexano à mistura de reação após o processo de metilação pode aumentar a

eficiência da metilação de ácidos gordos e é crítica para as amostras que contêm altos
níveis de triglicerídeos.

⮚ Adiciona-se uma solução aquosa saturada de NaCl para se verificar a formação de duas

fases, uma aquosa e outra orgânica. Como os FAME vão estar contidos na fase orgânica,
esta é a fase que interessa reservar para posterior análise.

Parâmetros do relatório

⮚ O cromatograma ajusta uma linha de base, mas por vezes este pode não ficar

completamente linear e assim ter de se fazer um ajuste que vai originar algumas variações
na área percentual.

⮚ Tempo de retenção – tempo que demora a aparecer o pico desde que a amostra foi

injetada. Depende das fases móveis e estacionárias a utilizar, assim como do fluxo do
eluente (ou gás de arraste).

✔ A percentagem da área está programada para ser contabilizada a partir de um

determinado tempo de retenção; assim, a área correspondente ao hexano não é

contabilizada, uma vez que este é apenas o solvente.
✔ É preferível utilizar a área percentual do que a área, uma vez que numa área
percentual podemos ter 48,7589% e numa área 8736249. Se omitirmos algum número
na área percentual o erro é quase insignificante, enquanto na área uma omissão de um
algarismo implica uma redução de 10x no valor real.
⮚ Normalmente as cromatografias em fase gasosa usam o princípio da volatilidade

(dependendo das colunas) – quando as colunas são apolares as amostras mais voláteis são
eluídas primeiro (o tempo de retenção é menor)

✔ Se se injetarem compostos padrão pode-se medir o tempo de retenção dos ácidos

gordos esterificados a testar e assim verificar a identidade dos ácidos gordos presentes
na amostra. Ver final do documento

⮚ ATENÇÃO! Os compostos que estão a ser eluídos não são os AG livres mas sim os ésteres

metílicos dos respetivos AG

Para a obtenção de FAMEs começou-se por se pesar uma determinada massa de óleo. A massa
de óleo de girassol pesada foi 𝑚 = (0, 034±0, 001) 𝑔 = (34±1) 𝑚𝑔.

Considerando que se utilizou 0,1 mL de padrão interno (ácido heptadecanoico, C17:0) de

concentração 15 mg/mL, foi possível obter a massa de padrão interno analisada de modo a
perceber qual a massa de cada ácido gordo presente na amostra.

1 𝑚𝐿 −−−−− 15 𝑚𝑔

0, 1 𝑚𝐿 −−−−− 𝑥 = 1, 5 𝑚𝑔

Os cálculos da massa de cada ácido gordo presente na amostra estão apresentados a seguir.
Todas as percentagens obtidas estão relacionadas com a massa de amostra. Assim, quando se
somam as percentagens para todos os ácidos gordos da amostra (e se retira o C17:0 que foi
utilizado como padrão) tem-se que
0, 02 + 0, 04 + 6, 59 + 2, 90 + 30, 06 + 55, 48 + 0, 03 + 0, 21 + 0, 22 + 0, 76 = 96, 31%

𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒𝑚 𝑑𝑒 𝐴𝐺 𝑖𝑛𝑠𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 = 31, 21 + 57, 61 + 0, 03 + 0, 23 = 89, 08 %

𝑃𝑒𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑔𝑒𝑚 𝑑𝑒 𝐴𝐺 𝑝𝑜𝑙𝑖𝑛𝑠𝑎𝑡𝑢𝑟𝑎𝑑𝑜𝑠 = 57, 61 + 0, 03 = 57, 64 %

✔ O óleo de girassol contém cerca de 15% de ácidos gordos saturados e 85% de ácidos

gordos insaturados, constituindo os ácidos oleico e linoleico cerca de 14 a 43% e 44 a 75%,

respetivamente, do teor de ácidos gordos insaturados deste óleo. Analisando os
resultados obtidos para o azeite e para os óleos de milho, amendoim, girassol e soja,
verificou-se que os ácidos gordos mais predominantes nestes óleos vegetais são os ácidos
linoleico (C18:2), oleico (C18:1) e palmítico (C16:0).

✔ Os óleos analisados experimentalmente apresentaram baixas quantidades de C20:0, C20:1

e C22:0, o que demonstrou que estes não possuem uma alta quantidade de ácidos gordos
com elevada massa molecular.

⮚ Os ácidos gordos mais benéficos para a saúde são os insaturados, uma vez que ajudam a

reduzir o risco de doenças cardíacas e diminuir os níveis de colesterol LDL, entre outros.
De entre estes destacam-se os ácidos gordos polinsaturados, tendo os ómega-6 ação
 anti-inflamatória e sendo os ómega-3 responsáveis por melhorar a saúde mental e
prevenir o risco de cancro e demência. A análise dos resultados obtidos pela turma
demonstrou que o óleo de soja é o mais rico em ácido α-linolénico, sendo por isso o óleo
mais adequado ao consumo humano; no entanto, todos os outros óleos analisados trazem
imensos benefícios para a saúde, devendo estar incluídos na dieta.

Notas sobre a cromatografia em fase gasosa

✔ O cromatógrafo utilizado tem um injetor automático, o que significa que se podem colocar

as amostras num frasco adequado e o cromatógrafo irá alternar as amostras com o

solvente das amostras (que neste caso é o hexano).

✔ Os cromatograma de gases começam a uma temperatura mais baixa, aumentando-se

gradualmente a temperatura. Este aumento da temperatura provoca uma alteração nas

condições cromatográficas (é o mesmo princípio da cromatografia de adsorção – o
hidrogénio é o eluente e a fase estacionária está a preencher a coluna de 30 m)

⮚ Uma das pontas da coluna é ligada ao injetor e outra ao detetor, sendo estas

extremidades presas com uma rosca para não deslizar. O injetor está sempre a uma
temperatura elevada, superior àquela que os compostos vão eluir para estes estarem
voláteis.

✔ Como o n-hexano é o composto menos volátil ele vai ser o primeiro a ser eluído.

✔ Os picos do solvente vão saturar o detetor, os dos compostos é que não podem

saturar senão a área de cada pico para os vários compostos não vai corresponder à
área verdadeira.

⮚ Pode-se alterar a temperatura e o fluxo do gás, o que permite modular o eluente. Pode

também alterar-se a fase estacionária mudando a coluna utilizada – o revestimento de

sílica da coluna é derivatizado e modificado para esta ser mais ou menos hidrofóbica
de acordo com o objetivo da cromatografia.

⮚ Se queremos quantificar compostos que estão numa quantidade mais vestigial,

podemos aumentar muito a quantidade de amostra para ficarmos apenas com os picos
 mais pequenos (se a concentração for muito elevada os picos maioritários ficam
truncados mas os picos minoritários ficam maiores, permitindo a sua quantificação).

ATENÇÃO! Por vezes podem ficar resíduos na coluna que a sujam (se ficar água na coluna
vamos ficar com vestígios de KOH que estava na fase aquosa; como este não é volátil vai ficar
retido na coluna). Assim, o comprimento da coluna vai diminuir à medida que se vão cortando
as zonas que têm resíduos; este procedimento vai alterar os tempos de retenção dos
compostos, o que faz com que de tempos a tempos se deva fazer passar os padrões de ácidos
gordos metilesterificados de modo a se obterem os tempos reais.