1.

Objetivo da Prtica:

Realizar a separao fsica de dois corantes atravs da tcnica da cromatografia lquida de gel filtrao, ou excluso molecular, ler as absorbncias, elaborar o cromatograma de separao e analisar a reprodutibilidade do mtodo e sua eficincia.

2.

Descrio da Amostra: Concentrao 10mg/mL 1mg/mL mx 620 560 Peso Molecular 2000000g/mol 300g/mol

Corante Azul de Dextran Vermelho de Fenol

Tabela 1: Descrio dos corantes

Estrutura Molecular do Azul de Dextrana

Estrutura Molecular do Vermelho de Fenol

3.

Materiais Utilizados 3.1. Materiais

Basto de vidro Cubetas de plstico Bureta Ependorf Ponteiras para pipetas automticas Tampo PBS (tampo fosfato salino) gua ultra pura Corantes Azul de Dextran e Vermelho de Fenol Resina Sephadex 3.2. Equipamentos Utilizados

Espectrofotmetro UV-Vis da marca FEMTO

 Coluna de Cromatografia Lquida Clssica Fase Estacionria: Resina Sephadex Fase Mvel : PBS 4. Metodologia A coluna de cromatografia lquida foi acoplada ao suporte universal, e adicionou-se um pequeno pedao de algodo hidroflico em sua extremidade. Preencheu-se, a coluna com a resina, resina esta que foi previamente colocada em aproximadamente 15 mL de soluo tampo PBS. A coluna foi empacotada durante cerca de 15 minutos, sem que se deixasse secar, adicionando-se cuidadosamente a soluo de PBS de forma contnua. Em seguida, 50 L de soluo de Azul de Dextran e aproximadamente 25 L de soluo de Vermelho de Fenol foram misturados em um tubo ependorf. Abriu-se a torneira para que a soluo PBS sasse e fechou-se quando apenas uma fina camada de soluo restava em cima da coluna de resina. A mistura foi injetada na coluna cuidadosamente para que no houvesse espalhamento com pipeta automtica, e a torneira foi aberta. Esperou-se que a mistura entrasse na coluna, e em seguida, cuidadosamente, adicionou-se coluna, soluo PBS como fase mvel. Iniciou-se a coleta de amostra em cubetas, com volume de aproximadamente 1 mL. A coleta foi iniciada logo aps a injeo da mistura dos corantes, a fim de se obter uma amostra constituda praticamente pela fase mvel. A coleta foi realizada at que no se observasse mais nenhum resduo de corante na coluna. Todas as cubetas foram ordenadas pelo tempo de sada, e submetidas leitura da absorbncia em espectrofotmetro, em dois comprimentos de onda: 560 nm e 620 nm . 5. Resultados

Volume (mL) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Absorbncias 1: 560 nm 2: 620 nm 0,000 0,000 0,005 0,010 0,003 0,002 0,000 0,007 0,062 0,098 -0,005 0,004 -0,012 -0,005 -0,028 -0,018 -0,026 -0,020 -0,003 -0,016 0,056 -0,020 -0,003 0,165 0,133 -0,019 0,058 -0,026 0,027 -0,011 -0,004 -0,021 -0,006 -0,015 0,022 0,016 -0,016 -0,016

19

-0,028
Tabela 2: Tabela de Resultados

-0,028

6.

Tarefas

a) Construa o cromatograma com as absorbncias lidas para cada corante e seus volumes de eluio, determinando o volume inicial e final das colunas. Com os resultados de absorbncias lidos, em cada comprimento de onda, para cada frao coletada, foi elaborado um cromatograma em funo do volume.

Vermelho de Fenol x Azul de Dextran

0.2

0.15

Absorbncia

0.1 620 nm 0.05 560 nm

0 0 -0.05 5 10 Volume (mL) Grfico 1: Cromatograma - Volume(mL) x Absorbncia 15 20

O volume inicial de amostra foi aproximadamente 75L e o volume final de amostra foi 19 mL, que corresponde ao volume total nas cubetas. De acordo com o cromatograma obtido, podemos identificar que para o comprimento de onda 560 nm, o detector, no caso o espectrofotmetro, foi capaz de determinar as duas substncias, apresentando assim dois grandes picos em seu cromatograma. O primeiro pico relacionado ao corante Azul de Dextran apresentando sua absorbncia mxima de 0,062 no volume 4mL. O segundo pico est relacionado ao Vermelho de Fenol apresentando sua absorbncia mxima de 0,165 no volume de 12mL. J para o comprimento de onda 620 nm, o mesmo no aconteceu, o detector foi capaz apenas de determinar o corante Azul de Dextran, apresentando assim apenas um grande pico no cromatograma, registrando no volume 4mL seu maior valor de absorbncia, 0,098. Em ambos os comprimentos de onda o detector se mostrou sensvel, porm para o comprimento de onda 620 o mesmo mais especfico.

b) O que aconteceu com o volume de amostra recolhido em relao ao que foi aplicado e por qu? Como foi citado no item anterior, o volume inicial sofreu uma diluio de mais de 250 vezes. Essa diluio ocorrida durante o processo de separao se deve a constante adio de fase mvel e ao processo de disperso das molculas dentro da coluna, visto que na mesma j apresentava fase mvel na hora da injeo. c) Por que as resinas devem ser guardadas em azida sdica? Onde atua a azida? O Sephadex, nome comercial da dextrana utilizada como resina na coluna de extruso, um conjunto de polissacardeos de -D-glicose. Essa resina deve ser armazenada em azida sdica, pois esta atua como um inibidor de crescimento microbiano, uma vez que os microrganismos podem ocupar os poros da resina, diminuindo sua eficincia, ou alterar algumas caractersticas fsico-qumicas da mesma. d) Como voc procederia caso desejasse trabalhar com maior volume de amostra? Para se trabalhar com volume maior de amostra, seria necessria uma bureta maior, para que possa suportar maior volume de fase estacionria, ou seja uma coluna maior. Isto provocaria uma maior eficincia de separao. e) Duas molculas de mesmo peso molecular obtiveram diferentes tempos de reteno. Explique. Duas molculas que possuem o mesmo peso molecular no necessariamente apresentam o mesmo tamanho, j que as mesmas podem apresentar arranjos diferentes, disposio de tomos diferentes. Na cromatografia de excluso molecular, a separao das substncias est baseada na diferena de tamanho, uma vez que, as menores substncias conseguem entrar nos poros da fase estacionria apresentando assim maiores tempos de reteno, j as maiores no conseguem entrar nos poros e assim so eludas mais rapidamente. Na prtica foi possvel identificar que o corante Azul de Dextran, que apresenta maior peso molecular e maior tamanho, foi o primeiro a sair da coluna em relao ao vermelho de fenol, que apresenta menor peso molecular e tamanho, de acordo com o esperado. f) Voc est utilizando uma Sephacryl 5-500 HR. Entretanto, a eluio est demorando excessivamente. O que fazer? Como a resina Sephacryl um gel mais rgido, mais viscoso que a Sephadex, ou seja, mais resistente a passagem da fase mvel, apresentando assim maior tempo de

corrida. Para resolver essa situao pode aumentar a presso da fase mvel, para assim aumentar a velocidade de eluio.

g) O que fazer quando a nica chance de separao de duas substncias atravs do aumento do "mesh" da resina e da ampliao do nmero de pratos tericos? O grau de reticulaes, ligaes cruzadas entre as cadeias, determinam o mesh de uma resina. Quanto menor o nmero de ligaes cruzadas entre as cadeias, maior ser o tamanho dos poros (maior o mesh). Ento para aumentar o mesh de uma resina basta utilizar uma com menor grau de reticulao. Porm este aumento do dimetro da partcula, piora a separao, tal fato pode ser compreendido pela Equao de Van Deemter, uma vez que aumenta a altura dos pratos tericos, diminuindo o nmero total dos mesmos. Uma forma de diminuir esse problema gerado pelo aumento dos poros da resina aumentar a velocidade da fase mvel atravs do aumento de presso. Esse aumento tem que ser controlado, pois se no pode danificar a integridade fsica da resina. h) Como voc calibraria a sua coluna? Para calibrar a coluna, utilizaramos padres conhecidos de um determinado analito, anotando seu tempo de reteno, as condies do meio, altura e tipo da fase estacionria, alm da fase mvel utilizada. Uma vez que, o mesmo analito apresenta o esmo tempo de reteno caso todas as condies da eluio.

7.

Discusso

Como pode ser visto no cromatograma obtido, houve uma boa separao dos corantes, porm o cromatograma apresentou uma linha de base muito instvel, fato esse que pode ter sido ocasionado por erros provenientes das cubetas utilizadas. J que foram utilizadas 19 cubetas diferentes, e as mesmas apresentavam diferentes estados de conservao, umas mais arranhadas que outras. As demais discusses j foram feitas no item tarefas.

8.

Concluso

A cromatografia lquida clssica se mostrou uma boa tcnica para separao de corantes, com um alto tempo de anlise. O erro sistemtico provocado pelo analista um fator determinante na hora da escolha pela CLC, erros como o de injeo e na adio de fase mvel podem resultar em fatores indesejados. Outra fonte de erro o uso das cubetas na espectrofotometria, visto que ao usar cubetas diferentes, qualquer falha nestas far com que o valor de absorbncia lido seja diferente do real.

9.

Referncias Bibliogrficas Apostila, Anlise Insturmental: Cromatografia Lquida de Alta Eficincia. Centro Federal de Educao Tecnolgica de Qumica-RJ

Disponvel em: http://www.gbiosciences.com/ResearchProducts/Blue-DextranLoading-Dye.aspx - Acessado em 16/06/2012. Disponvel em: <http://www.jornallivre.com.br/123476/composto-quimicoazida-de-sodio.html> Acesso em: 17/06/2012.