Métodos de

Purificação de
Proteínas Nativas
Disciplina: Métodos de Análise e Purificação de Proteínas

Prof. Dr. Marcos Túlio de Oliveira

Créditos a Ms. Flávia Campos Freitas Vieira e Prof. Pisauro.

 Métodos de Purificação de Proteínas

1. Trabalhando com proteínas;

2. Purificação Proteica;

3. Métodos Cromatográficos;

4. Análise de Proteínas.
 Trabalhando com Proteínas

• Compreensão sobre estrutura e função de

proteínas  proteínas individuais;

• Separadas de outras de forma pura, para a

determinação de suas propriedades;

• Proteína pura  essencial para que suas

propriedades e atividades sejam determinadas.
 Trabalhando com Proteínas

• SEMPRE! trabalhar com proteínas em baixa

temperaturas (0 a 4ºC)!!!

• Usar tampão correto (pH, cofatores,

estabilizadores, etc.)
 Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína

Métodos clássicos Métodos modernos

Diferença de Clonagem de DNA,

propriedades das sequenciamento
proteínas: carga, genômico, chips de
tamanho, ligantes. proteínas, etc.
 Trabalhando com Proteínas

• Proteína nova  precedentes estabelecidos e bom senso.

• Mais de um método de purificação utilizado.

• Levar em consideração métodos descritos para proteínas

semelhantes.

• Iniciar com métodos de baixo custo.

Estratégia Geral para Obtenção da Proteína
Purificada
Isolamento
• Extração 1. Material de Partida -----
Separação
- Extrato Bruto
2. Desintegração celular

Fracionamento

Diálise
•Solubilidade
Ultra filtração
•Tamanho
•Carga Coluna
Cromatografica
•Afinidade Ligação
Purificação Proteica: Fonte Proteica
Purificação Proteica: Isolamento
Extrato Bruto
 Material Duro

Agitação com pequenas French Press

partículas (beads)
 Material Mole

Choque osmótico
• Transferência rápida de uma solução isotônica
para uma solução hipotônica.
• Devido a osmose as células ficam túrgidas
provocando a lise da membrana.

Ruptura por tratamento químico

• Usa-se solvente orgânico ou detergente para
romper diferentes tipos de tecidos, células e
organelas. Ex: álcalis, solventes, detergentes e
ácidos.
Vamos começar a purificação!
 Centrifugação diferencial

• Centrifugação diferencial é usada para

separar organelas, pedaços de
membranas e citosol (fração solúvel do
citoplasma) do extrato celular.
 Purificação Proteica: Fracionamento
• Fracionamento  Separação das proteínas do
extrato em diferentes frações com base no
tamanho, carga.

Diferenças na solubilidade proteica

Função do pH, temperatura, concentração de sais e outros

fatores.
 Purificação Proteica: Fracionamento
• Salting out
• Precipitação proteica com elevada concentração
salina.
• ((NH4)2SO4) sulfato de amônio
• A adição de um sal na quantidade correta pode
precipitar algumas proteínas e manter outras em
solução
 Purificação Proteica: Preparação
• Solução proteica passa por modificações para uma
purificação eficiente.

• Diálise: separa proteínas de pequenos solutos se

aproveitando do maior tamanho das proteínas.

• Ex: Remoção de sulfato de

amônio da amostra.
 Métodos Cromatográficos

Cromatografia em Coluna

• Poderoso método de fracionamento.

• Diferença de tamanho, carga, afinidade de

ligação e outros.

• Velocidade da migração depende da

propriedade da proteína.
Lehninger, 5ª ed. 2010
 Métodos Cromatográficos
Tipos de Cromatografia em Coluna:

o Troca Iônica (Aniônica e Catiônica);

o Gel-filtração ou Exclusão por tamanho;

o Afinidade;

o Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC).

 Cromatografia de troca iônica
• Baseado nas diferenças de sinal e magnitude da carga
elétrica líquida de proteínas em um dado pH.

• Resina:
o Trocadora de cátions (grupos aniônicos);
o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).
 Cromatografia de troca iônica
• Afinidade afetada:
o pH (determina o estado de ionização da molécula);
o concentração dos íons dos sais livres que competem
na solução circundante.
 Cromatografia de troca catiônica

• Matriz carregada negativamente.

• Proteínas com carga líquida

positiva migram mais lentamente.

• Expansão da solução proteica na

fase móvel:
o separação de proteínas com diferentes
propriedades
o espalhamento difusional.

Lehninger, 5ª ed. 2010

 Cromatografia de troca catiônica
• Tamanho da coluna aumenta, a resolução de
dois tipos de proteínas com cargas líquidas
também aumenta.

• A velocidade da solução proteica diminui com o

tamanho da coluna.

• Quanto mais devagar a solução proteica gasta na

coluna, a resolução diminui (espalhamento
difusional).
 Cromatografia de exclusão por tamanho

• Ou gel-filtração.

• Separação por tamanho.

• Fase sólida: grânulos de polímero com

ligações cruzadas, com poros de tamanho
específico.

• Proteínas grandes saem da coluna antes que

as pequenas.
 Cromatografia de exclusão por tamanho

• Proteínas grandes não

entram nas cavidades e
são eluídas mais
rapidamente.

• Enquanto proteínas
menores percorrem um
caminho maior dentro dos
poros.

Lehninger, 5ª ed. 2010

 Cromatografia de afinidade

• Baseado na afinidade de
ligação.

• Resina: ligante (grupo químico

covalentemente ligado).

• Proteínas com afinidade se

ligam ao ligante.

Lehninger, 5ª ed. 2010

Cromatografia de
Afinidade

 Pequenas proteínas são

ligadas aos suportes e a
mistura complexa de
proteínas é aplicada

 Proteínas ligadas podem

ser eluídas com
moléculas pequenas ou
reagentes
• Formado um complexo entre proteína e
ligante.

• As proteínas que não se ligam são

lavadas da coluna.

• Proteína de interesse é eluída com uma

elevada concentração de sal e do ligante
livre.

• O sal interfere nas ligações iônicas que

ligam a proteína ao ligante.

• O ligante livre se liga a coluna de

afinidade.
Lehninger, 5ª ed. 2010
 Cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC)

• Bombas de alta pressão

aceleram o movimento de
moléculas de proteína
através da coluna.

• Reduzindo o tempo de
trânsito na coluna, a difusão
de bandas é diminuída e a
resolução aumentada.
Como analisar o resultado da purificação?
(como visualizar proteínas e determinar a
pureza da amostra?)

• Absorbância 280nm

• SDS-PAGE
A280
A280
 Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.

• Migração afetada pela massa-carga e forma da

proteína.
 Eletroforese de Proteínas
• Contribui com grande carga negativa.
• SDS (sodium dodecyl sulfate) desdobra parcialmente
as proteínas, assumindo forma semelhantes.
SDS-PAGE
Ação do SDS
 Eletroforese de Proteínas
Vantagens

• Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar

proteínas.

• Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas

presentes em uma amostra ou o grau de pureza.

• Permite determinação do ponto

isoelétrico e massa molecular
aproximada.
 Eletroforese de Proteínas
• Separação, quase exclusivamente, pela massa molecular.

• Polipeptídeos menores migram mais rápido.

• Visualização com Coomassie ou Nitrato de Prata.

• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
 Eletroforese Bidimensional

• Combinação sequencial da
focalização isoelétrica e SDS-PAGE.

• Separação de mistura complexa

proteica.

• Mais sensível que os métodos

isolados.

• Massa molecular e pI.

 Resumindo...
• Proteínas são separadas e purificadas com base nas
diferenças de suas propriedades.

• Proteínas podem ser seletivamente precipitadas por

mudanças no pH ou temperatura e, particularmente, pela
adição de certos sais.

• Métodos cromatográficos faz uso de diferenças de

tamanho, afinidades de ligação, carga e outras
propriedades

• Todos os procedimentos de purificação exigem um

método para quantificação ou análise da proteína de
interesse na presença de outras proteínas.
Proteina X
• Citoplasmática
• Peso molecular (616,487 g/mol)
• Caráter ácido
• Possui calda poli His
Proteina X
• Coletar o material
• Romper a membrana celular para liberação do
EXTRATO BRUTO
• Centrifugar
• Descartar as partes que não serão utilizadas e
manter as partes utilizáveis
• Utilizar métodos cromatográficos (Ni-Sepharose)
Próxima aula: Métodos de Purificação
de Proteínas Recombinantes