TRABALHANDO COM

PROTEÍNAS
N E L S O N , D AV I D L . ; C O X , M I C H A E L M .   P R I N C Í P I O S D E B I O Q U Í M I C A D E L E H N I N G E R .   P O R T O A L E G R E : A R T M E D ,
2 0 11 . 6 . E D . P O RT O A L E G R E : A RT M E D , 2 0 1 4 .
 Química de proteínas
Purificação de proteína
Milhares de proteínas
propriedades
Atividades
INTRODUÇ Métodos clássicos
ÃO  tamanho
 carga
 propriedades de ligação
Clonagem do DNA
Sequenciamento do genoma
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA

Fracionament
o
• Tecido • Propriedade
• Célula • Extrato • tamanho
bacteriana bruto • carga
• Preparação Proteínas em
Lise celular de organelas diferentes
frações
PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA-
FRACIONAMENTO
Solubilidade de proteínas
pH
Temperatura
concentração de sais
 salting out
(NH4)2SO4

Fonte: Nehete et al, 2013

PURIFICAÇÃO DE
PROTEÍNA-
PREPARAÇÃO
EXTRATO PARCIALMENTE
PURIFICADO
Diálise: procedimento que separa
proteínas de solutos pequenos se
aproveitando do tamanho maior das
proteínas
*remoção do sulfato de amônio da
preparação proteica.

Fonte: Protein Purification Methods

Foundations of Clinical Sciences em
comis.med.uvm.edu
CROMATOGRAFIA
EM COLUNA
É utilizada pelos métodos mais eficientes para
fracionar proteínas
Diferenças na carga das proteínas, tamanho,
afinidade de ligação e outras propriedades.
Diferentes tipos de colunas
Proteínas individuais migram com mais rapidez ou
lentidão através da coluna, dependendo de suas
propriedades

Fonte:Lehninger, 6ª ed. 2014

CROMATOGRAFI
A DE TROCA
IÔNICA
 Diferenças no sinal e magnitude da
carga elétrica final de proteínas
Permutadores de cátions
Permutadores de ânions
Afinidade é afetada
 pH (que determina o estado de ionização
da molécula)
 concentração de íons de sais livres
 * Otimização (gradiente de pH ou de sal)

Fonte:Lehninger, 6ª ed. 2014

 CROMATOGRAFIA DE
EXCLUSÃO POR
TAMANHO
Filtração em gel
Separa as proteínas de acordo com o tamanho
A fase sólida consiste em grânulos de polímeros
reticulados com poros ou cavidades projetados com
um determinado tamanho
Proteínas grandes
Proteínas pequenas
Estimação do tamanho de uma proteína que está
sendo purificada

Fonte:Lehninger, 6ª ed. 2014

 CROMATOG
RAFIA DE
AFINIDADE
Baseada na afinidade de ligação
Ligante
Ex: Proteínas com função biológica
que envolve ligação com ATP
 proteínas ligadoras de ATP se ligam à
matriz
 Lavagem de proteínas que não se
ligaram na coluna
 Solução contendo uma solução
contendo uma alta concentração de sal
ou um ligante livre – nesse caso o ATP
ou um análogo do ATP.
 Eluição da proteína de interesse
Fonte:Lehninger, 6ª ed. 2014
HPLC - CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE
ALTO
DESEMPENHO

Fonte: High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) - Ibsen Photonics -

 ELETROFOR
ESE
Separação de proteínas baseada
na migração de proteínas
carregadas em um campo elétrico
Estimar:
 Número de proteínas diferentes em
uma mistura
 Grau de pureza de uma preparação
proteica específica.
 Massa molecular

Determinar: PONTO
ISOELÉTRICO

Fonte:Lehninger, 6ª ed. 2014

 ELETROFORESE
 Gel de poliacrilamida
 retardar a migração de proteínas
 carga
 massa
 Equação:
 m: mobilidade eletroforética
 E: potencial elétrico
 V: velocidade
 Z: carga final da molécula
 f : coeficiente de fricção (forma de uma proteína)
 Forma e tamanho
 ESTIMATIVA DA MASSA
MOLECULAR DE UMA PROTEÍNA
Dodecil sulfato de sódio (SDS)

Carga negativa: anula a carga intrínseca

Provoca desdobramento da proteína: formas
semelhantes

Separação com base na massa molecular

Corante: azul de Coomassie

Comparação com proteínas de massa molecular

conhecida

Fonte:Lehninger, 6ª ed. 2014

FOCALIZAÇÃ
O
ISOELÉTRICA
Ponto isoelétrico: pH no qual a
carga liquida é zero
Uma solução de um anfólito (Base
e ácido de baixo peso molecular)
Carga elétrica
Migração das proteínas até que
encontre o pH que coincide com
seu pI
Proteínas com pontos isoelétricos
diferentes são, assim, distribuídas
de modo diferente ao longo do gel
ELETROFORESE
BIDIMENSIONA
L

Focalização isoelétrica +
eletroforese em SDS
É um método analítico mais
sensível do que qualquer
método eletroforético sozinho
Separa:
 proteínas de massa molecular
idêntica que diferem em seu pI
 proteínas com valores de pl
semelhantes, mas com massas
moleculares diferentes.
 ENZIMAS
Efeito catalítico que a enzima produz
Pré-requisitos:
1.a equação geral da reação catalisada
2. um procedimento analítico para determinar o desaparecimento do
substrato ou o aparecimento de um produto de reação
3. se a enzima necessita de cofatores, como íons metálicos ou
coenzimas
4.a dependência da atividade enzimática da concentração do substrato
5. pH ótimo
6. uma zona de temperatura em que a enzima é estável e possui alta
atividade.
ENZIMAS
1,0 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de
enzima que promove à transformação de 1,0 mmol de substrato em produto
Atividade: que se refere às unidades totais de enzima em uma solução.
 Atividade específica é o número de unidades de enzimas por miligrama de
proteína total
 pureza enzimática.
OUTRAS
PROTEÍNAS
Proteínas de transporte: ligação à molécula que
elas transportam
Hormônios e toxinas pelo efeito biológico que
produzem;
(crescimento de certas células em cultura)
OBRIGADA!