UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E PATOLOGIA
CURSO DE GRADUAÇÃO EM BIOMEDICINA
DOCENTE: GISELY CASTRO
DISCENTE: KAYLLANY MARIA DE ANDRADE DA SILVA
(MATRÍCULA 20200127867)

Estudo Dirigido
“Citometria de fluxo, Diálise e Eletroforese”

JOÃO PESSOA - PB
2023
 Estudo Dirigido

1. Defina Eletroforese.

A eletroforese é uma técnica laboratorial realizada com o objetivo de separar

moléculas de acordo com o seu tamanho e carga elétrica para que se possa ser
realizado o diagnóstico de doenças, seja verificada a expressão de proteínas ou se
possa identificar microrganismos.

Para a realização dessa técnica, é necessário um conjunto de sistemas formado por

um suporte de fracionamento, uma cuba de eletroforese, uma fonte de voltagem e
uma solução tampão. O suporte pode ser de acetato de celulose, gel de agarose ou
poliacrilamida e tubos capilares. A cuba é um equipamento formado por dois
compartimentos preenchidos com solução tampão, formando os eletrodos, sendo um
positivo e o outro negativo. A fonte de voltagem é um aparelho que transforma a
corrente alternada em contínua, podendo ter a intensidade regulada. É essa fonte que
determina a polaridade dos compartimentos da cuba. A solução tampão é formada
por água, sal ácido e sal básico. Tal solução pode ser ácida ou alcalina, sendo
específica para cada tipo de eletroforese, dada pelo grau de molaridade ou força
iônica da solução.

Existem dois métodos para a realização da eletroforese. Na eletroforese convencional

por zonas, as proteínas migram através dos poros presentes em suportes como
acetato de celulose, gel de agarose ou poliacrilamida, formando zonas de proteínas
no eletroforetograma. Já na eletroforese capilar as proteínas são separadas pelo
tamanho e por outras propriedades físico-químicas, através do fluxo em um tubo
capilar.

2. Explique como a técnica de eletroforese pode ser utilizada na identificação de fragmentos

de DNA.

O método indicado para a identificação de fragmentos do DNA é a eletroforese em

gel.

A molécula de DNA apresenta carga negativa uma vez que possui grupos fosfatos
em sua cadeia principal. Ademais, todas as moléculas de DNA têm a mesma
quantidade de carga por massa. Por essa razão, a eletroforese em gel de fragmentos
de DNA faz a separação baseada apenas no tamanho.

Nesse sentido, explicando como funciona o processo, primeiramente o gel deve ser
colocado em uma caixa de gel. Uma extremidade da caixa é ligada a um eletrodo
positivo, enquanto a outra extremidade é ligada a um eletrodo negativo. O corpo
principal da caixa, onde o gel é colocado, é preenchido com uma solução tampão
contendo sal para conduzir a corrente. Depois, as amostras de DNA são colocadas
nos poços do gel. A seguir, a caixa é ligada e a corrente começa a fluir através do gel.
As moléculas de DNA têm carga negativa devido aos grupos fosfato em seus
esqueletos de açúcar-fosfato, assim elas começam a se mover através da matriz de
gel, para o polo positivo. Quando a energia é ligada e a corrente passa através do gel,
diz-se que o gel está correndo.

Dessa forma, pedaços curtos de DNA vão viajar através dos poros da matriz de gel
mais rapidamente que os mais longos. Após o gel ter corrido por algum tempo, os
pedaços mais curtos de DNA vão estar mais próximos do polo positivo do gel,
enquanto os mais longos vão permanecer próximos aos poços. Tendo em vista que
os fragmentos tenham sido separados, pode-se examinar o gel e ver quais tamanhos
de faixas são encontrados. Quando um gel é pigmentado com um corante que se liga
ao DNA e depois colocado sob luz UV, os fragmentos de DNA brilham, o que permite
visualizar o DNA presente em diferentes locais ao longo da extensão do gel.

Ao finalizar o processo, uma parte bem definida de DNA em um gel é chamada de

banda. Cada banda contém um grande número de fragmentos de DNA do mesmo
tamanho e todos os que viajaram, como um grupo, para a mesma posição. Ao
comparar as bandas em uma amostra à escada de DNA, pode-se determinar os
tamanhos aproximados.

3. Defina citometria de fluxo.

A citometria de fluxo é uma técnica usada para o estudo morfológico, fenotípico e

funcional de células por meio da percepção da dispersão da luz e da fluorescência
emitida por moléculas denominadas fluorocromos que são ligadas a elas. Tal
metodologia é aplicada principalmente nas áreas da imunologia, englobando estudos
de avaliação funcional e diferenciação de populações celulares; conteúdo de DNA e
RNA; atividades enzimáticas; apoptose; produção de íons; citotoxicidade; modulação
de receptores; distribuição populacional; produção de citocinas, entre outros.

4. Diferencie detectores de luz dispersa de detectores de luz fluorescentes.

Os detectores de luz dispersa captam a luz dispersada pela célula, o que permite
visualizar características como o tamanho da célula e também a sua granulação, Já
os detectores de luz fluorescentes captam a luz emitida pelos fluorocromos, que
estão ligados às moléculas de interesse.

5. Descreva o funcionamento de um citômetro de fluxo.

O citômetro de fluxo emprega 3 sistemas: um óptico, um de fluidos e um sistema

eletrônico.

O sistema de fluidos é responsável por inserir e conduzir as células em suspensão,

enquanto o sistema óptico gera e capta sinais a partir de lasers, filtros e detectores.
Já o eletrônico O sistema eletrônico, por sua vez, amplifica e converte os sinais
advindos dos detectores, gerando dados que podem ser analisados sob múltiplos
parâmetros.
De maneira específica, células são previamente tratadas com anticorpos marcados
com fluorocromos. Estes anticorpos, então, ligam-se ao alvo de interesse e as células
são submetidas a um fluxo hidrodinâmico, que se estabelece com a injeção
controlada de um fluido composto por solução salina. Durante o fluxo, a mistura de
amostra com solução salina passa por uma câmara (flow cell), cujo diâmetro pode
chegar a 50μm. Esse processo, chamado de foco hidrodinâmico, obriga as células a
ficarem “empilhadas”, permitindo que a luz incida nelas de maneira individualizada.
Os lasers utilizados variam em composição e devem ser cuidadosamente
selecionadas de acordo com o tipo de análise a ser realizada, considerando a
amostra e o fluorocromo utilizado para marcar o anticorpo. Os comprimentos de onda
utilizados variam entre 300 nm e 500 nm. Ao passar pelos feixes de luz, a célula
refrata parte dessa luz na direção e sentido do laser (Forward Scatter – FSC) e outra
parte a 90º (Side Scatter – SSC); esta etapa é chamada de interrogação. Em seguida, a
luz dispersa é filtrada por cores (com espelho dicróicos) e captada por dispositivos
chamados de Tubos Fotomultiplicadores (PMTs).

Após a captação das fluorescências, as mesmas são convertidas em sinal eletrônico,

e a informação obtida de cada célula que é interceptada pelo laser é representada,
através de software específico, em histogramas e/ou gráficos de pontos.

6. Considerando a imagem abaixo como o resultado de uma análise em citometria de fluxo,

qual ou quais os receptores identificados nas células que aparecem em maior percentual?

De acordo com a imagem, seria o receptor CD3

7. Defina Diálise.

A Diálise é um processo de separação por membranas, onde há o transporte de uma

suspensão ou solução por meio de uma barreira semipermeável, a qual ocorre a
separação seletiva dos componentes sob efeito de uma força motriz gerada devido a
diferença de potencial químico entre o retido e o dialisado. Dois parâmetros
importantes nesse produto são a massa molar de corte, que é determinada pelo
tamanho dos poros e o fluxo, definido como o volume que atravessa a membrana por
área e tempo.
8. Descreva como ocorre a purificação de macromoléculas através da técnica de diálise

As membranas de diálise podem ser classificadas em hidrofílicas, nanoporosas,

homogêneas ou de troca iônica. No caso da separação de macromoléculas, pode-se
ser aplicada a diferença de gradiente de concentração, uma vez que o fluxo da
membrana é de natureza difusiva, as macromoléculas se difundem no meio em que
se encontram, através dos poros da membrana inchados pelo solvente. Assim, o
transporte acontece pois os poros da membrana são muito pequenos, o que favorece
o movimento das moléculas menores, já que as moléculas maiores possuem
coeficiente de difusão baixo.