Relatório Científico da Disciplina Bioquímica experimental

Curso de Química - bacharelado

ANÁLISE DE PROTEÍNAS POR ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-

PAGE)

Bárbara Cristina Caldas de Ávila; Larissa Calixto; Renata Aparecida de Jesus Neves.

Universidade Federal de São João del-Rei Departamento de Ciências Naturais, Campus Dom Bosco,
Praça Dom Helvécio, 74 – Fábricas, São João del-Rei – MG, CEP 36301-160

Relatório realizado no dia 24 de junho de 2022

1. Introdução

A eletroforese é uma técnica analítica capaz de separar partículas carregadas em um campo

elétrico uniforme através da capacidade das proteínas de se ionizarem em diferentes valores de pH,
quando um campo elétrico é aplicado. O princípio é baseado nas Leis de Coulomb, em que a principal
força motriz para o movimento das partículas carregadas em um campo elétrico é a diferença de
potencial aplicada entre os eletrodos. O eletrodo positivo (ânodo) atrai ânions (íons negativos) e o
eletrodo negativo (cátodo) atrai cátions (íons positivos). Consequentemente, quanto maior a intensidade
da voltagem aplicada, maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.
Entretanto, se a voltagem utilizada for muito alta pode gerar muito calor e ressecar o suporte, além de
poder desnaturar as partículas que estão sendo submetidas à separação. [1]
A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétrico não depende somente da
sua quantidade de cargas ou da diferença de potencial aplicada entre os eletrodos, mas também da massa
relativa da molécula. O tamanho da macromolécula ou massa relativa também influencia de forma
decisiva na sua velocidade de migração. Quanto maior a massa relativa de uma partícula menor será a
sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal contrário. [2]
A base de estudo para a obtenção e detecção de cada classe de marcador bioquímico ou de DNA
reside no uso de eletroforese. O termo foi criado por Michaelis em 1909 para descrever a migração de
colóides sob a influência de um campo elétrico. A eletroforese pode ser feita sem suporte (eletroforese
livre) ou com o uso de suportes. A eletroforese livre foi desenvolvida por Arne Tiselius, em 1937 mas
está em desuso. As diferentes técnicas de eletroforese empregam, um suporte sólido como papel ou gel
que evita a mistura das proteínas por convecção e permite utilizar pequenas quantidades de material.[2]
A eletroforese em suporte foi inventada por um brasileiro chamado Paulo Koenig, em 1937. Ele
trabalhava no Instituto Butantan, em São Paulo, e usou o papel como suporte para separar proteínas de
venenos ofídicos. Os suportes sólidos permitem a separação de acordo com a carga elétrica das
partículas, ou seja, moléculas de mesma carga ou mesmo pI não são separadas neste tipo de suporte. [2]

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 O suporte em gel promoveu um grande avanço na eficiência de separação das frações
submetidas à eletroforese. Isto se deve ao fato do gel ser um polímero com poros que permite a
separação das partículas não somente pela carga mas também pela massa relativa. O gel dificulta a
migração das partículas de massa grande e facilita a migração de partículas de massa pequena. Para isto,
é preciso variar o tamanho dos poros do gel de acordo com a faixa de massa relativa. [2]
O gel de poliacrilamida, utilizado na eletroforese de proteínas, é um gel composto de polímeros
reticulados e age como uma peneira molecular, retardando a migração de proteínas em proporção à sua
razão carga-massa. A migração de uma proteína em um gel durante a eletroforese é, portanto, uma
função do seu tamanho e formato. A força que move a macromolécula é o potencial elétrico (E) e, após
a eletroforese, as proteínas são visualizadas pela adição de um corante, como o azul de Coomassie, que
se liga às proteínas, mas não ao gel em si. Assim, é possível monitorar o progresso de um procedimento
de purificação de proteínas à medida que o número de bandas de proteínas visíveis no gel diminui após
cada nova fase de fracionamento. Quando comparada às posições para as quais as proteínas de massa
molecular migram no gel, a posição de uma proteína não identificada pode fornecer uma boa estimativa
de sua massa molecular. Se a proteína tem duas ou mais subunidades diferentes, as subunidades são
geralmente separadas por tratamento com SDS, e uma banda separada aparece para cada uma delas. [1]
A eletroforese em gel na presença de SDS (dodecil sulfato de sódio) é um método bastante usado
para o cálculo do peso molecular das proteínas. É possível determinar a massa de uma proteína através
da comparação com proteínas de massa conhecida (proteínas padrão). No gel, é reservada uma canaleta
para aplicação das proteínas de massa relativa conhecida e em uma segunda canaleta aplica-se a
proteína de massa desconhecida, como ilustrado na Figura 1. Depois da corrida eletroforética mede-se,
com o auxílio de uma régua, a migração das proteínas padrão e da desconhecida. Constrói-se uma curva
padrão que representa a mobilidade eletroforética de cada proteína padrão frente ao logaritmo do peso
molecular. Com isto obtém-se uma reta que pode ser utilizada para determinar a massa relativa de uma
proteína que se quer estudar. [4]

Figura 1: Eletroforese em gel vertical. A amostra é aplicada nas canaletas posicionadas no topo do gel. A
corrida eletroforética ocorre de forma descendente, do cátodo para o ânodo. [2]

O SDS é um detergente negativo que rompe todas as ligações covalentes da proteína que perde
sua conformação tridimensional e se desenrola. O SDS liga-se às proteínas formando um complexo de
carga negativa. As proteínas quando tratadas com o SDS adquirem carga negativa e a separação ocorre
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baseada apenas na diferença de massa relativa entre elas. Neste sistema as proteínas de menor massa
relativa migram com maior velocidade.[4]

Figura 2: Ilustração do detergente dodecilsulfato de sódio (SDS) [1]

Figura 3: Estrutura do Dodecil sulfato de sódio (SDS)[1]

Uma variante desta técnica, conhecida pela sigla SDS PAGE, emprega um gel de poliacrilamida,
em presença do detergente dodecilsulfato de sódio (SDS) para estimar a pureza e a massa molecular de
proteínas.. Um SDS ligado contribui com uma grande carga final negativa, tornando a carga intrínseca
da proteína insignificante e conferindo a cada proteína uma razão carga-massa semelhante. Cada
molécula de detergente liga-se a grupos hidrofóbicos das proteínas, causando sua desnaturação, de
modo que a maior parte das proteínas ligadas ao SDS assume uma forma semelhante a bastonetes.
Todas as proteínas de uma mistura apresentam carga negativa e migram em direção ao pólo positivo,
peptídeos menores migram mais rapidamente. O resultado é a formação de um complexo com forma
alongada, com uma densidade de cargas negativas proporcional ao comprimento da cadeia
polipeptídica. Esta associação, com a maioria das proteínas, segue o mesmo padrão: uma molécula de
SDS a cada dois resíduos de aminoácidos. A eletroforese também pode ser utilizada para determinar
propriedades cruciais de uma proteína, tal como seu ponto isoelétrico, e estimar sua massa molecular.[1]

Figura 4: Ligação entre uma proteína nativa e o SDS (dodecil sulfato de sódio). O SDS forma um
complexo de carga negativa com a proteína. [2]

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 2. Objetivos

Analisar as proteínas por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida.

3. Experimental
3.1 Instrumentos, materiais e reagentes

Balança, Centrífuga, 1 barra magnética, tubos de ensaio(15), 1 pipeta automática 200 μl ,1 pipeta
automática 10 μl ,ponteiras,1 béquer de 250 mL,1 béquer de 100 mL, 2 béquer de 50 mL, pipeta de
pasteur, espátula, frasco para pesagem.

Reagentes

Solução de Bis/Acrilamida; Tampão do gel separador – TrisHCl pH 8,6; Tampão do gel

empilhador – Tris-HCl, pH 6,8; Dodecil sulfato de sódio - SDS 10 %; TEMED: tetrametiletilenoamina;
Persulfato de Amônia (PSA) -10% (Preparado no momento do uso); Tampão de extração: Tris-HCl 6,8,
SDS, glicerol, azul de bromofenol; Tampão de tanque: Tris-HCl 8,6, glicina, SDS, Álcool comercial (96
%); Butanol; Solução corante; Solução descorante.

3.2 Procedimento

Parte A: Montagem do gel

Inicialmente, limpou-se cuidadosamente com álcool 70% todos os componentes do sistema de

eletroforese. Montou-se as placas e espaçadores fora do suporte, e colocou-se a placa no aparato de géis,
onde foi testada se havia vazamento. Preparou-se o gel separador e o verteu entre as placas com a ajuda
de uma pipeta, tomando cuidado para não formar bolhas, até o limite demarcado para o gel empilhado r.
Uma fina camada de butanol foi colocada sobre a solução do gel para nivelar a porção superior do gel.
Após 15 minutos ocorreu a polimerização do gel, o butanol foi retirado e a extremidade superior do gel
foi lavada com água destilada. O gel empilhador foi preparado, e o pente foi colocado no gel. Após, o
gel empilhador foi adicionado à placa de forma rápida. Aplicou-se as amostras preparadas em cada
poço, deixando correr em uma voltagem de 100 mV por 40 min. Logo após, retirou-se o gel do suporte
com cuidado. Após 20 minutos ocorreu a polimerização total do gel.

Parte B - Preparo das amostras

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 A amostra dialisada previamente diluída e a amostra do extrato bruto de proteína foram
centrifugadas por 5 minutos a 2500 rpm. O sobrenadante foi recolhido e diluído no tampão de extração
em uma proporção 5:1. Logo após foi colocada em banho fervente por 5 minutos.

Parte C - Aplicação das amostras no gel e corrida

As amostras preparadas são aplicadas no gel. Inicialmente as placas foram acopladas no suporte,
o tampão foi colocado no espaço entre placas até cobrir o gel, verificando assim possíveis vazamentos.
Utilizando a pipeta, as amostras foram aplicadas em suas respectivas raias (aproximadamente 20
microL). Os suportes contendo a placa de gel foram colocados em uma cuba específica do kit. O tampão
de tanque foi adicionado na cuba até cobrir a parte inferior das placas (cerca de 1 cm acima). Com o
auxílio de uma seringa foram eliminadas bolhas que se formavam na parte inferior do gel. Após
encaixar os eletrodos, o aparelho foi ligado para a execução da corrida utilizando um potencial de 100
mV. Após duas horas a corrida se completou e foi observado que o azul de bromofenol saiu pela parte
inferior do gel.
Parte C - Coloração do gel

Ao final da corrida o gel foi retirado com muito cuidado com o auxílio de uma espátula larga e
colocado em um recipiente contendo água e manteve agitação manual. Foi realizada uma lavagem com
água destilada por 3 vezes para retirar o excesso de SDS. Para a visualização das bandas no gel de
poliacrilamida, foi realizada a etapa de coloração das proteínas, em que foi adicionado solução de
fixação, corante Coomassie, e incubado a temperatura ambiente por 30 minutos sob agitação leve, para
evitar a quebra do gel.

4. Resultados e discussão
No experimento, a amostra protéica dialisada e a amostra bruta após serem centrifugadas e os
outros reagentes foram colocados em poços no topo do gel de SDS-poliacrilamida. Ao fim do processo
e da coloração do gel, foi possível observar que cada banda no gel representa uma proteína diferente (ou
subunidade de proteína); proteínas menores se movem através do gel mais rapidamente que as maiores
e, portanto, são encontradas mais próximas da base do gel. É possível observar que as bandas maiores
devido ao maior tamanho, permanecem na parte superior do gel enquanto que as bandas menores são
capazes de percorrer todo o gel e se posicionam na parte inferior. [1]

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 Figura 5: Suporte de eletroforese em gel

A mobilidade vai depender da interação relativa da molécula com a fase estacionária e a fase
móvel. A variação da porcentagem de poliacrilamida nogel permite alterar o tamanho dos seus poros, o
que significa que se pode separar diferentes tamanhos de proteína em diferentes porcentagens das
concentrações de géis.[4]
Como a velocidade da migração depende do tamanho da molécula, em um determinado
momento da eletroforese, moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz.
Pela diferença nos tamanhos dos poros das matrizes, o gel de poliacrilamida serve para separação de
fragmentos menores de até 1 kb. [5]

Figura 6: Placa contendo o gel com as amostras

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 Figura 7: Lavagem do gel com água destilada

A poliacrilamida é formada pela polimerização de dois compostos, acrilamida e bis-acrilamida

(N,N'-metileno-bis-acrilamida), em uma reação iniciada por tetrametiletilenodiamina (TEMED) e
persulfato de amónio (PSA). O PSA ativará o TEMED, que por sua vez ativará o monômero de
acrilamida iniciando o processo de polimerização, formando assim uma rede de porosidade bastante
uniforme.[7]

Figura 8: Reação de polimerização de acrilamida.[9]

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 Figura 9: Estrutura poliacrilamida [7]

O TEMED é utilizado para auxiliar na polimerização, catalisando a reação, ou seja, reduzindo a

energia de ativação. Assim, com a menor energia de ativação requerida o tempo para que a reação
ocorra se reduz. [7]

Figura 10: Estrutura do Tetrametiletilenodiamina-TEMED

Figura 11: PSA -Persulfato de amônio [8]

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 As proteínas possuem carga negativa e positiva. Para todas, ocorrerem no gel, de forma
uniforme, sem que haja choque entre moléculas de cargas opostas é utilizado o dodecil sulfato de sódio,
ou SDS, que auxilia a lise celular, desnaturando as proteínas e ligando-se a elas atribuindo-lhes carga
negativa. Uma vez iniciada a polimerização, o gel é vertido entre 2 placas de vidro e deixado
polimerizar completamente. A mistura de gel é composta em tampão de eletroforese (Tris-HCl), que
fornece os íons para a formação da corrente na eletroforese. [3]
A primeira parte é um gel de resolução, com um pH em torno de 8,8, o que diminui a migração
das proteínas. Em cima do gel de resolução, é derramado um gel de empilhamento, com um pH de 6,8 e,
com poros maiores. Esse gel de empilhamento é o último a ser colocado, trabalha para comprimir as
amostras de proteínas em uma frente fina de migração, de modo que todas as proteínas da amostra
cheguem ao gel de resolução ao mesmo tempo, levando a uma migração relativa precisa. Os géis são
moldados dessa maneira, para que ambos os géis, de empilhamento e resolução, formem um gel
contínuo, e permite que uma quantidade muito maior de proteína seja carregada no gel.
A cuba vertical de gel de eletroforese também é dividida em 2 seções, uma câmara superior
(interna) e uma câmara inferior (externa). Essas duas câmaras são ligadas pelo gel de poliacrilamida
para criar um circuito contínuo. Cada câmara contém um eletrodo, negativo na câmara interna e positivo
na câmara externa. A câmara interna entra em contato com o topo do gel e, quando um campo elétrico é
aplicado, as proteínas se direcionam para o eletrodo positivo na câmara tampão externa, devido às
cargas negativas das moléculas de SDS. [4]
A velocidade da migração através do gel é determinada pelo gradiente de voltagem, isto é, a
voltagem entre os eletrodos. A força de campo necessária está relacionada ao tamanho da cuba de
eletroforese utilizada e a voltagem necessária pode ser calculada usando a equação:

V
E= Equação 1
d
onde:
"E" é a força de campo
"V" a voltagem e
"d" a distância em centímetros entre os eletrodos.

Para aplicar esse campo elétrico, utiliza-se uma fonte de alimentação. A maioria das fontes de
eletroforese pode ser configurada para fornecer corrente e voltagem constantes, cada uma com
vantagens e desvantagens. Uma questão em potencial é a produção de calor devido ao fluxo de corrente
através do sistema, que pode ser especialmente alto em cubas maiores, que requerem uma voltagem
mais alta. [4]
Após a migração, as proteínas devem ser visualizadas para determinar seu comprimento e
abundância. Existem vários métodos comumente usados para visualizar proteínas específicas ou não
específicas. A visualização não específica tem como alvo todas as proteínas, usando corantes que se
ligam a regiões comuns das proteínas, como os grupos amino. Exemplos de corantes de proteína não
específicos incluem Coomassie Brilliant Blue e Ruby Pro. A coloração não específica pode ser útil para
quantificar rapidamente as amostras em um gel ou para garantir a presença de uma amostra de interesse.
[4]

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 Figura 11: Estrutura do corante Coomassie [10]

Figura 12: Gel obtido ao fim da coloração

As bandas reveladas pelos géis de poliacrilamida indicam que os resultados obtidos para os
diferentes grupos compartilham um mesmo padrão de tamanhos de fragmentos, quando comparados. As
bandas confirmam a separação das proteínas por meio de seu peso molecular.
A quantificação das proteínas visualizadas pode ser feita com a utilização de outras técnicas
analíticas.

5. Conclusão

Conclui-se que os métodos utilizados para a extração da proteína da soja foram satisfatórios, e o
processo de separação das proteínas da amostra bruta também foi satisfatório já que foi possível
observar as raias e as porções de proteínas presentes. Algumas porções se misturaram, evidenciando que
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proteínas com massa molar muito próximas estão presentes na amostra. A eletroforese foi inventada por
Arne Tiselius, em 1937 com o objetivo de separar partículas orgânicas. No mesmo ano, Paulo Koenig
no Brasil introduziu a eletroforese com suporte e que até hoje é largamente usada. A eletroforese
consiste em um método laboratorial com o objetivo de separar frações de proteínas, enzimas, lipídios,
hemoglobina, DNA e RNA. A técnica é fundamentada na separação de partículas que apresentam cargas
elétricas em um determinado pH.

6. Referências bibliográficas

[1] Nelson, David L. Princípios de bioquímica de Lehninger/ David L. Nelson, Michael M. Cox; 6°
edição. Porto Alegre: Artmed, 2014.

[2]https://cesad.ufs.br/ORBI/public/uploadCatalago/
11163316022012Biofisica_para_Biologos_aula_5.pdf. Acesso em 08/07/2022

[3] MARZZOCO, Anita e TORRES, Bayardo Baptista. Bioquímica básica. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan.

[4] https://www.neobio.com.br/blog/a-eletroforese-em-gel-de-poliacrilamida. Acesso em 05/07/22

[5]https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38073/1/DISSERTA%C3%87%C3%83O
%20Anadeje%20Celerino%20dos%20Santos%20Silva.pdf. Acesso em 07/07/22

[6]https://www.merckmillipore.com/BR/pt/product/Dodecyl-sulfate-sodium-salt,MDA_CHEM-822050.
Acesso em 07/07/22

[5]https://repositorio.ufsc.br/bitstream/handle/123456789/103319/277995.pdf?
sequence=1&isAllowed=y. Acesso em 10/07/22

[7]https://www.puc-rio.br/ensinopesq/ccpg/pibic/relatorio_resumo2010/relatorios/ctc/qui/QUI-Alex
%20Andrade%20de%20Lima.pdf. Acesso em 07/07/22

[8] https://pt.wikipedia.org/wiki/Persulfato_de_am%C3%B4nio. Acesso em 07/07/22

[9] https://sites.google.com/site/enzineticupiig/sds-page/electroforesis-en-gel-poliacrilamida. Acesso em

08/07/22

[10] https://www.sigmaaldrich.com/BR/pt/product/mm/112553. Acesso em 07/07/22

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