Índice

1. Introdução ................................................................................................................................... 2

2. Objectivos................................................................................................................................ 2

2.1. Objectivo geral ................................................................................................................. 2

2.2. Objectivos específicos ...................................................................................................... 2

3. Descrição geral dos sistemas automáticos .................................................................................. 3

3.1. Primeira fase: Aspiração e divisão da amostra..................................................................... 3

3.2 Segunda fase: Processamento de amostra ............................................................................. 3

3.3. Terceira fase: Determinação analítica de celula ou do parametro de interesse .................... 3

3.4. Quarta fase: Processamento de sinais e emissão do resultado ............................................. 3

4. Tecnologia dos sistemas automatizados multiparamétricos ....................................................... 4

4.1. Princípios básicos para contagem de células no sangue ...................................................... 4

4.2. Determinação do número de células por volume de sangue ................................................ 5

4.3. Formas gráficas de resultados .............................................................................................. 5

4.4. A contagem automática de reticulocitos: o reticulograma! .................................................. 6

4.4.1. Métodos baseados na fluorescêncis ............................................................................... 7

4.4.2. Métodos baseados na absorção de luz (Absorvância) ................................................... 7

5. Princípio fundamental do funcionamento do aparelho automático ............................................ 7

5.2. Canal de impedância elétrica................................................................................................ 8

5.3. Canal de espectrofotometria ................................................................................................. 9

6. Erros no hemograma automatizado ............................................................................................ 9

7. Conclusão.................................................................................................................................. 10

8. Bibliografias .............................................................................................................................. 11
1. Introdução
A citometria de fluxo é uma poderosa ferramenta que possibilita realizar a separação, a
contagem individual de células e detecção de biomarcadores proteicos. A partir de um
feixe de laser incidente, é feita a medição da dispersão e da fluorescência do feixe de
laser refletido pela da amostra celular. A dinâmica funcional de um citômetro é composta
por cinco sistemas: fluido, óptico, eletrônico, de amplificação e computacional. O presente
trabalho vai falar sobre automatização dos processos laboratoriais e principalmente para o
Laboratório Clínico de Hematologia cujo o princípio dessa automatização é baseado na
"citometria de fluxo".

2. Objectivos
2.1. Objectivo geral
❖ Conhecer a técnica automatizada utilizada no laboratório clínico;

2.2. Objectivos específicos

❖ Descrever as fases do funcionamento dos analizadores hematológicos;
❖ Conhecer o princípio do funcionamento dos analizadores hematológicos

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3. Descrição geral dos sistemas automáticos
Geralmente são quatro as fases para a análise de amostra de sangue nos diversos contadores
multiparamêtricos.

3.1. Primeira fase: Aspiração e divisão da amostra

A amostra de sangue é aspirada e dividida em dois ou mais canais paralelos de processamento.
Dependendo do modelo do homogenizador o sangue é homogenizado e aspirado
automaticamente (modelos mais completos) no sistema para tubo fechado (opcionalmente
aberto), ou necessita que as amostras sejam homogenizadas e aspiradas manualmente (sistema
apenas para tubo aberto), para os modelos mais simples. O processo de separação de amostras
em seus respectivos canais de processamento geralmente é feito por uma validade de separação
denominada shear valve.

3.2 Segunda fase: Processamento de amostra

Em cada respectivo canal de processamento amostra é diluída e tratada de modo a facilitar e
permitir a contagem ou a mensuração do respectivo parametro de interesse (por exemplo
contagem de eritrócitos, leucócitos, plaquetas, dosagem de hemoglobina etc.). É nesta fase que as
células são coradas, ou a lise de determinado tipo celular é realizada para distinguir a célula de
interesse das demais.

3.3. Terceira fase: Determinação analítica de celula ou do parametro de interesse

É a fase de análise propriamente dita corresponde a contagem ou a mensuração do cenário ou do
conteúdo da célula de interesse pela determinação de suas características de frequência de pulsos
elétricos, impedância e/ou característica de expressão ou absorção de luz, e/ou características
citoquímicas, e/ou característica de incorporação de fluorocromos em sua estrutura celular, e/ou
marcação com anticorpos monoclonais, e/ou a dosagem de algum outro parâmetro específico
como dosagem de hemoglobina (por exemplo de modo isolado ou simultâneo) essas
características sinais elétricos ópticos derivadas de cada célula são computados, guardadas no
software do aparelho.

3.4. Quarta fase: Processamento de sinais e emissão do resultado

Os sinais elétricos e ou ópticos computados no software do aparelho são transformados em
resultados padronizados como celular por milímetros cúbicos ou microlitros e percentagem

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celular de hemoglobina em gramas por decilitro, indices hematimetricos, gráficos em forma de
histogramas, ou se programas eventuais alarmes para alteração específica.

4. Tecnologia dos sistemas automatizados multiparamétricos

Os diversos computadores multiparamétrico do mercado além do uso clássico da foto me tria
para a dosagem de hemoglobina em princípios elétricos princípios óticos Em ambos associados
ou não a métodos químicos (coloração citoquímica ou distribuição química direcionada com
preservação de tipos celulares específicos), citometria de fluxo celulas analisadas em fluxo
continuo avaliadas em relação as suas características de pressão ou de absorção de luz),
imunofluorometria ( células marcadas com anticorpos monoclonais associados a fluorocromos),
fluorometria (detecção de fluorocromos) fluorometria (detecção de fluorocromos - intesidade de
fluorescência nas células marcadas com fluorocromos sem a intermediação dos anticorpos
monoclonais), dentre outros para contagem de diferentes tipos celulares sangue.

4.1. Princípios básicos para contagem de células no sangue

A presença de uma célula é detectada pelas alterações elétricas ou óticas geradas quando da sua
pesagem através de uma pequena abertura os diversos contadores detecta a presença deu uma
célula como uma resposta gerada quando tal celular passa por um campo eletromagnético
(pequena abertura). Com base nas diferentes propriedades biofísica das células diferentes
tecnologias são empregadas para criar os diferentes sistemas de detecção.

A mais Notável alteração gerada por uma célula em campo magnético é a oscilação frequência.
O método elétrico ou impedância elétrica escrito por Coulter em 1956, baseia-se essencialmente
na oscilação de corrente gerada pela célula quando da sua passagem por um campo elétrico
estático. As alterações geradas em campo óptico de frequência por uma célula são a base para o
princípio de dispersão ou de absorção de luz no método ótico de contagem. Assim demônio do
filme Gigante príncipe elétrico os métodos óticos baseia-se nas nas alterações dá dispersão de luz
geradas por uma célula quando da sua passagem por um campo óptico. Em praticamente todos os
contadores são utilizados o sistema de arraste continuum e uma correção para coincidência de
células contadas o que evita que uma célula seja contada repetidamente.

Hoje sabemos quê sinais elétricos de baixa frequência são definidos principalmente pelo volume
celular e que sinais elétricos de alta eu conhecia são definidos pela complexidade interna da

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célula. Para o princípio óptico atualmente também sabemos que a luz dispersa abaixo ângulos
determina o volume de uma célula a luz dispersa ângulos maiores define o índice de refração ou
a densidade interna da célula.

Além é claro muita precisão de resultados certamente outra grande contribuição dos contadores
multiparamétrico é a capacidade de simultaneamente a contagem de uma célula poder determinar
outras de suas características. A primeira das características pode ser avaliada foi a determinação
do tamanho celular. Desta forma pode sentando em um mesmo canal de Contagem discriminam
era para voltar mais tipos distintos de células.

Na prática as células após contadas e terem seus tamanhos determinados são separadas em
diferentes classes e o resultado final Expresso como uma curva de distribuição de volumes. Para
que isso se tornasse possível dois pontos básicos tiveram de ser estabelecidos: primeiro uma
relação precisa entre o sinal elétrico emitido pela célula e seu tamanho. Segundo um limite
diferencial entre ruídos electricos.

4.2. Determinação do número de células por volume de sangue

Independentemente do princípio utilizado a contagem de células é feita diretamente por meio da
relação da Contagem efetuada em tempo e volume da amostra pré-estabelecidos ou seja pelo
acúmulo de um total de células contadas pela sua passagem em fluxo por um detector em um
espaço de tempo e em um volume conhecidos.

4.3. Formas gráficas de resultados

Histogramas: nesse formato os resultados são dispostos graficamente ilustrando a medida de
distribuição de frequência determine o sinal de amplitude de distribuição (parâmetro), no eixo X,
como, por exemplo, o tamanho da célula versus a quantidade de célula (frequência) para aquele
parametro em um eixo Y. É a forma clássica de expressar graficamente uma população de
herbívoros de plaquetas ou diferencial de leucócitos em três partes.

Citogramas: nesse formato do gráfico cada ponto em impressora apresenta dois parâmetros para
cada célula contada. Portanto, os resultados são plotados célula a célula, como pontos
específicos em um gráfico que cruza dois parametros distintos; por exemplo: tamanho versos
conteúdo celular. Esse formato de resultado é muito utilizado encontradores nos quase a
passagem de uma célula pode ser lotada simultaneamente os dois com mais detectores que

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avaliam propriedades físicas distintas para aquela célula. Um exemplo comum é a avaliação
simultânea por um método óptico em que um detector é usado para mensurar a luz dispersa de
uma célula e o outro detector é utilizado para me curar a luz absorvida por aquela mesma célula.
Inúmeros princípios associados associados de detenção são utilizados atualmente pelos diversos
fabricantes. O citograma é é a forma clássica de expressar graficamente a contagem de carência
de leucócitos Cinco partes a contagem de reticulocitos ou especificamente uma população de
reticulocitos que custa valores de volume concentração de hemoglobina ou nas contagens de
plaquetas nas quais o volume e índice de refração são correlacionados.

4.4. A contagem automática de reticulocitos: o reticulograma!

Hoje é sem dúvida a contagem automatizada de reticulocitos é um poderoso recurso para o
diagnóstico diferencial e a monitorização terapêutica de uma anemia Em contrapartida a
importante, Porã de pouca responsabilidade, Contagem manual em esfregaço corado com base
apenas em valores percentuais e por milímetros cúbicos a contagem automatizada reticulocitos
conta com até mais de deixa para avaliação em ponto de convergência para a investigação dos
mais variados tipos de anemias.

De certo, em minuto pouco tempo, o perfil reticulocitário automatizado, o reticulograma, vai se

tornar tão comum quanto os hemogramas automatizados como dado rotineiro para avaliação de
uma anemia. Sua maior vantagem em relação às avaliações dos eritrócitos do eritrograma
automatizado no diagnóstico precoce e na monitorização terapêutica de uma anemia decore o
fato de serem células com tempo de vida média infinitamente menor que o dos eritrócitos.

Os eritrócitos e vivem cerca de 120 dias na circulação os reticulocitos por sua vez circulam como
tal por apenas um dia na circulação Ou no máximo por três a quatro dias quando liberados
Precon semente pela medula óssea induzida por relevantes níveis de eritropoetina circulante. Por
tal motivo ir para receber avaliar o perfil de uma população de celular que pode ser renovada no
máximo 3 a 4 dias em vez de ter que aguardar 40 dias para que o perfil de determinada anemia se
alterem em decorrência deu uma terapia específica ou se faça notar para a caracterização
morfológica e seu diagnóstico por intermédio dos perfis hematimétricos eritrograma. Sem dúvida
o retículograma é a abordagem do futuro. É só uma questão de tempo e divulgação clínica.

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Os Métodos automatizados para Contagem direito e grosso baseiam-se ou no princípio da
fluorescência emitida pelos reticulocitos, pelo uso de fluorocromos com afinidade pelo ARN
reticulocitário.

4.4.1. Métodos baseados na fluorescêncis

Neste método além de contador os reticulócitos são subclassificadas de acordo com a intensidade
de fluorescência alguns contadores separam apenas os reticulócitos imaturos com alta
fluorescênci; outros os subdividem em três classes de alta, média e baixa fluorescência.

4.4.2. Métodos baseados na absorção de luz (Absorvância)

Esses métodos, além de contar os reticulócitos subclassificam-nos de acordo intensidade de
absorção de luz após coloração automatizada específica. De modo semelhante aos métodos por
fluorescência, também se podem subdividir os reticulócitos em três classes: reticulocitos de alta,
média e baixa absorção de luz ou absorvancia. Os métodos por absorção de luz tendem a
superestimar as contagens de reticulocitos nos casos de amostras com elevado número de
eritroblastos ou na presença de corpos de Howell-Jolly.

5. Princípio fundamental do funcionamento do aparelho automático

Os parâmetros hematológicos baseiam-se na medição de células em quatro canais
independentes. Os glóbulos brancos (WBC) são analisados por dois canais distintos: o canal de
fluxo ótico (WOC) para a contagem diferencial, e o da impedância (WIC) para a quantificação;
os glóbulos vermelhos (RBC) e plaquetas (PLT) são medidos num segundo canal de impedância
elétrica; ao passo que a hemoglobina (HB) é medida no canal de espetrofotometria. Com base
nos cálculos de Wintrobe, são igualmente obtidos os índices eritrocíticos: o hematócrito (HCT),
a hemoglobina celular média (CHM) e a concentração de hemoglobina corpuscular média
(CHCM) (manual Cell-Dyn, 1996).
5.1. Canal de fluxo ótico
No canal WOC, o sangue é diluído numa solução de sheat que mantém a integridade celular dos
WBC, mas que torna os RBC transparentes ao laser, não interferindo desta forma na contagem
dos WBC. Induzida pela geometria da célula de fluxo e pela corrente de sheat, a amostra diluída
sofre então focagem hidrodinâmica, que obriga as células a formarem uma simples fila enquanto
passam pela região de sensores, de forma a serem analisadas uma a uma.
Com referência à tecnologia MAPSS TM (Multi-Angle Polarized Scatter Separation), são

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efetuadas quatro medidas simultâneas de dispersão da luz em cada leucócito: -o ângulo 0º
determina principalmente o tamanho da célula – o volume corpuscular médio (VCM); -a
dispersão da luz a 10º indica a estrutura ou a complexidade da célula (diferencia os mono dos
polinucleares); -a dispersão da luz a 90º separa as células granuladas como a lobularidade; -a
dispersão de luz despolarizada a 90º resolve os eosinófilos através da deteção dos grânulos.

A informação das quatro medidas é interpretada através das alterações na luz dispersa pelas
células, enquanto passam pelo detetor, dando a contagem diferencial para classificar a
subpopulação dos WBC.

5.2. Canal de impedância elétrica

Existem dois canais de impedância elétrica que determinam o WIC e o RBC/PLT
individualmente. O método de impedância elétrica consiste numa suspensão de células, que são
consideradas más condutoras, numa solução de condutividade elétrica, forçadas a passar uma a
uma, por um orifício de tamanho conhecido. Esse orifício é ladeado por dois elétrodos, de forma
a criar um campo elétrico.

As alterações na corrente existente entre os elétrodos, que ocorrem aquando da passagem das
células resistentes, são detetadas e registadas sob a forma de impulsos. A quantidade gerada é
indicativa do número de células que passam pela abertura, e a amplitude é proporcional ao
volume da célula que o gerou, permitindo assim diferenciar pelo tamanho, no canal RBC/PLT,
os eritrócitos das plaquetas.

De facto, se o impulso gerado está acima do limiar inferior da PLT, é contado como tal; e se o
impulso gerado está acima do limiar inferior dos RBC, é contado como um RBC (manual Cell-
Dyn, 1996).
No canal WIC, a amostra de sangue é diluída com uma solução diluente, que lisa os eritrócitos,
tornando o citoplasma dos WBC mais visível. As medidas são interpretadas pelo Cell-dyn
através das mudanças na impedância elétrica, à medida que as células passam pelo detetor.
É de referir que os dois métodos (ótico e impedância elétrica) permitem uma contagem mais
precisa do número de WBC, na presença de certas substâncias interferentes ou em condições
patológicas, embora o WOC seja o primeiro valor reportado como contagem dos WBC (manual
Cell-Dyn, 1996).

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5.3. Canal de espectrofotometria
Depois de a contagem WIC estar concluída, a amostra é transferida para a célula de fluxo de
hemoglobina. No canal de HB, a amostra é então diluída com a solução CN-Free WIC/Hb Lyse,
que converte a hemoglobina num simples cromogéneo (hemoglobinhydroxilanine complex)
(manual Cell-Dyn, 1996).
A leitura colorimétrica é efetuada por um detetor, que mede a luz transmitida a 540nm, sendo a
concentração da hemoglobina diretamente proporcional à absorvância da amostra.

6. Erros no hemograma automatizado

➢ Colecta de amostra inadequada;
➢ Deterrioração de EDTA;
➢ Uso de tubo que está fora de prazo;
➢ Demora na homogenização;
➢ Aspiração lenta da amostra para tubo;
➢ Formação de agregados plaquetários;
➢ Sangue envelhecido (sangue conservado em temperatura ambiente mais de 12h);
➢ Amostra hemolizada.

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7. Conclusão
A citometria de fluxo foi desenvolvida como um instrumento poderoso para a descoberta
dos fenômenos celulares. Essa tecnologia, ao fornecer a quantificação precisa de
parâmetros celulares físicos (tamanho e granulometria) e químicos (quantidade de proteína
expressa, por exemplo), permite que células de interesse sejam descobertas ou testadas
diante de diversas situações de pesquisa. Pode ser destacada, a título de ilustração de sua
importância, a detecção de subpopulações de linfócitos em pacientes vítimas da síndrome
da imunodeficiência adquirida (AIDS), parâmetro essencial para acessar a condição clínica
e definir tratamentos mais específicos para cada doente. A medicina pode se beneficiar de
forma acentuada da utilização de citômetros de fluxo na pesquisa e mesmo na prática
clínica. Difundir a importância e desmistificar a utilização dos citômetros contribuirá de
sobremaneira nas análises clínicas.

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8. Bibliografias
1. OLIVEIRA, Raimundo António Gomes - Hemograma: como fazer interpretação, 1ª edição
2007;

2. MILLER O., GONÇALVES REIS R. – Laboratório para o clínico, 8ª edição Atheneu,

1999;

3. SOBREIRA, Paula Cristina Borges Pinheiro - Relatório de estágio mestrado em análises

clínicas.
By George Da Josina, Técnico

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