Eletroforese em Gel de Agarose

A eletroforese em gel de agarose é usada como método analítico e preparativo, pois,

uma vez resolvidas, isto é, separadas as moléculas de DNA, um fragmento de
tamanho específico pode ser excisado do gel e purificado para, posteriormente ser
usado em uma gama de procedimentos utilizando técnicas de manipulação genética

Os géis de agarose comumente preparados na rotina de laboratórios são indicados

para separar fragmentos de DNA que variam entre poucas centenas de pares de
bases até cerca de 40-50 kb. Para fragmentos com tamanhos menores, é indicada a
eletroforese em gel de poliacrilamida ou a utilização de agaroses especiais,
quimicamente modificadas.

Com temperatura próxima de 60ºC, a solução é transferida para um molde utilizado

para o preparo do gel. Após a gelificação, o diâmetro dos poros da matriz formada é
diretamente proporcional à concentração do polímero utilizada.

Em razão da presença de grupamentos fosfato, a molécula de DNA possui carga

negativa em pH neutro ou alcalino. Consequentemente, quando aplicada a um gel e
submetida a um campo elétrico, essa macromolécula migrará em direção ao anodo,
ou seja, pólo positivo.

A velocidade da migração bem como o poder de resolução de um gel dependem do

tamanho e da forma da molécula. Para a visualização e a interpretação dos
resultados, são necessárias a incorporação de um agente intercalante de DNA
(brometo de etídeo) e a utilização de marcadores de massa molecular apropriados,
de maneira que migrem em paralelo às amostras de interesse.

Tamanho da molécula de DNA e concentração do gel – As moléculas maiores migram

mais lentamente em razão de um maior efeito friccional de arraste e porque as
mesmas promovem menor aquecimento em seu trajeto de migração através dos
poros do gel. O tamanho da molécula de DNA, dado em número de pares de bases
(pb), é diretamente proporcional à massa molecular que é dada em Daltons (Da). A
densidade do gel determina o intervalo de tamanho das moléculas que podem ser
adequadamente separadas.

Existem diferentes tipos de marcadores com massa molecular variando desde

poucos pares de bases até dezenas de kb. O tamanho de uma molécula de DNA pode
ser determinado com precisão razoável se um marcador de massa molecular
adequado migra em paralelo com as moléculas que estão sendo fracionadas.

Quando a concentração desses marcadores é conhecida, pode-se fazer uma

estimativa visual de concentrações desconhecidas das amostras por comparação
direta da intensidade das bandas. Quantificações mais acuradas devem ser feitas por
densitometria. No entanto, onde houver necessidade de determinar concentrações
desconhecidas com alta precisão, a espectrofotometria é a metodologia mais
indicada.

• Conformação do DNA – O DNA apresenta três formas distintas que migram em

velocidades diferentes no gel de agarose. As formas são: circular superenovelada
(forma 1), circular relaxada (forma 2) e linear (forma 3). A motilidade das diferentes
formas pode variar de acordo com o tamanho da molécula de DNA e também
depende do diâmetro dos poros do gel, voltagem e força iônica do tampão de
corrida. A forma 1 migra mais rapidamente que a forma 3, e a forma 2 é a mais lenta.
A forma 1 é a mais rápida, em razão do seu menor diâmetro.

• Agentes intercalantes – O brometo de etídeo é um análogo de base que se

intercala na molécula de DNA e emite fluorescência quando exposto à luz
ultravioleta (UV). As moléculas de DNA fracionadas em géis de agarose contendo
brometo de etídeo são diretamente visualizadas na presença da luz UV, e o limite de
detecção é cerca de 10 ng/banda de ácido nucléico.

A intensidade de fluorescência é diretamente proporcional à massa molecular do

fragmento de ácido nucléico. Apesar de ser bastante ampla a faixa de UV,
geralmente, o comprimento de onda mais utilizado para detecção de ácidos
nucléicos é de 300-360 nm (nanômetros). O brometo de etídeo diminui a motilidade
do DNA, e esse retardamento na corrida se deve ao aumento no tamanho e na
rigidez das formas linear e circular relaxada.
O efeito intercalante retarda a corrida da forma linear cerca de 15% e é mais
pronunciado no DNA relaxado, pois nesse tipo de conformação a presença de
brometo de etídeo induz à formação de superenovelamento positivo, que acarreta
aumento na motilidade eletroforética.
• Voltagem – As moléculas de DNA migram através do gel com velocidade
diretamente proporcional à voltagem aplicada, essa correlação acontece até o limite
de 5V/cm, que é a distância entre os eletrodos. A linearidade é perdida quando se
aplica uma voltagem maior, então as moléculas maiores migram mais rapidamente
que as menores.

• Tampão de corrida - A composição e a força iônica do tampão de corrida

influenciam na migração e na qualidade de resultado da eletroforese. Os tampões
mais usados são o TAE (Tris-Acetato-EDTA) e TBE (Tris-Borato-EDTA). O TBE tem um
custo mais alto que o TAE, porém apresenta maior capacidade tamponante,
enquanto o TAE promove uma corrida cerca de 10% mais rápida quando o DNA
apresenta-se sob forma linear. Entretanto, a capacidade de resolução de DNA de fita
dupla é semelhante nos dois tampões. A baixa força iônica promove uma migração
muito lenta, e a alta força iônica provoca alta condutividade elétrica, gerando calor e
podendo desnaturar o DNA.

Cuidados Importantes na Utilização da Técnica

Essa técnica exige o uso de materiais perigosos e mutagênicos (luz UV e brometo de

etídeo), portanto é necessário cuidados importantes na sua manipulação e
desenvolvimento, como:

- usar luvas para manipular géis ou soluções contendo brometo de etídeo, que é um
potente agente mutagênico;

- usar óculos e outros equipamentos de proteção ao trabalhar com a luz UV, já que a
mesma é mutagênica;
- a agarose fundida pode eventualmente borbulhar, por isso não se deve agitar o
erlenmeyer logo após a fusão, para evitar queimaduras.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

A eletroforese em gel de poliacrilamida é uma técnica amplamente usada para a

separação de biomoléculas, tais como os ácidos nucléicos e as proteínas. Os géis de
poliacrilamida são constituídos pela polimerização da acrilamida e da N,N’ –
metilenobisacrilamida, que é induzida por radicais livres, e apresentam poros de
dimensões moleculares, sendo que a separação nessas malhas é baseada tanto nos
princípios da filtração em gel como na mobilidade eletroforética das moléculas.
Nesse sentido, nesse tipo de eletroforese, as grandes moléculas têm sua migração
retardada com relação às moléculas de menor tamanho.

O sistema de poliacrilamida consiste em dois géis que apresentam composição e

função diferentes: o gel de empacotamento (concentrador) e o gel de corrida
(separador). O primeiro é constituído por uma malha de grande porosidade (gel de
poliacrilamida a 5%), e sua função é compactar a amostra em um pequeno volume,
depositando-a sobre a superfície-limite do gel separador como uma “banda
estreita”.  Já o segundo é constituído de uma malha de poros menores
(poliacrilamida na faixa de 8% a 20%), com a função de separar as proteínas ou
DNAs, em razão de suas massas moleculares.

Na maioria dos casos, o tampão nos reservatórios da cuba de eletroforese apresenta

pH e força iônica diferentes do tampão usado para confeccionar o gel (sistema
descontínuo). Depois de aplicada, a amostra é arrastada por uma fronteira de íons
em movimento, que é criada quando a corrente elétrica passa através dos eletrodos,
do pólo negativo em direção ao pólo positivo. A combinação do sistema descontínuo
do tampão com a grande porosidade do gel concentrador promove o efeito de
empacotamento da amostra, o qual é crucial para a alta resolução desse sistema de
separação.

Após a separação, as proteínas ou DNAs podem ser visualizados segundo diversas

metodologias de coloração, detecção imunológica ou radioativa. Cada um desses
sistemas de detecção apresenta o requerimento de um protocolo específico para sua
execução. As duas principais metodologias de coloração utilizam o corante azul
brilhante de Coomassie ou sais de prata (soluções amoniacais de prata ou nitrato de
prata). A coloração de prata é cerca de cem a mil vezes mais sensível que a coloração
de Coomassie, podendo detectar moléculas em quantidade de 0,1 a 1,0 ng em uma
única banda. 

Assim, pode-se definir um parâmetro padrão envolvendo as seguintes etapas:

1) Montagem da cuba de eletroforese e confecção do gel de poliacrilamida. Ao
contrário da eletroforese em gel de agarose, que utiliza uma cuba horizontal para
corrida do gel, a eletroforese em gel de poliacrilamida utiliza uma cuba vertical;

2) Verter o gel de corrida, e assim que esse polimerizar, verter sobre ele o gel de
empacotamento e introduzir imediatamente o pente para formação dos poços;

3)   Após a polimerização, remover o pente e limpar os poços;

4)   Adicionar o tampão aos reservatórios e aplicar as amostras;

5)   Conectar os eletrodos à fonte de corrente e ligá-la. A corrente sempre irá do pólo

negativo ao pólo positivo;

6)    Após o término da corrida, realizar a coloração para visualização do gel.

Cuidados Importantes na Utilização da Técnica

- Os reagentes acrilamida e bisacrilamida são neurotóxicos, e seus efeitos são
cumulativos, portanto é obrigatório o uso de luvas e máscara para manipulação
desses reagentes.