Extração de DNA

Dogma Central da Biologia Molecular

Replicação
Transcrição Tradução
DNA RNA Proteína
Transcrição
reversa
 Ácidos nucleicos
Macromoléculas formadas a partir de nucleotídeos

Grupo Fosfato

Açúcar (uma pentose que

pode variar)

Base Nitrogenada
(pode variar)
 DNA RNA
Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico

Dupla fita Fita simples

Contém a informação genética Transmite a informação genética

Bases nitrogenadas: Adenina, Timina, Bases nitrogenadas: Adenina, Uracila,

Citosina e Guanina Citosina e Guanina

Ligações químicas: Lig. fosfodiéster Ligação química:

e Lig. de hidrogênio Lig. fosfodiéster

Origem: Replicação Origem: Transcrição

 Extração de DNA/RNA
Pode ser feita a partir das seguintes amostras:
• Sangue,
• Biópsias e esfregaços,
• Fragmentos de tecidos,
• Culturas de células,
• Cultivos microbiológicos,
• Sêmen,
• Folhas,
• Insetos,
• Etc.
 Extração de DNA/RNA
1) O DNA é mais estável.

2) O RNA é rapidamente degradado após a

coleta - pode ser evitada com o
congelamento das amostras em nitrogênio
IMPORTANTE: líquido, com o uso de reagentes
conservantes e trabalhando no gelo!

3) Todo o material utilizado em técnicas de

ser estéril, para evitar contaminação do DNA ou
Extração de DNA

Preparo da amostra:

• Acondicionamento adequado após a coleta – essencial para preserver a

amostra.
• Amostras líquidas (sangue, urina ou liquor) – centrifugação para a
separação de células nucleadas, no precipitado, ou de partículas virais, no
sobrenadante.
• Amostras sólidas (biópsias, fragmentos de tecidos, folhas, etc) – passam
por quebra das estruturas rígidas, por picotação ou maceração, para
aumentar a superfície de contato com os reagentes.
 Extração de DNA
Lise celular:

Rompimento das células com soluções tamponadas contendo:

1. Detergente – rompimento das membranas e a liberação do
conteúdo celular.
2. Reagente Tris – mantém o pH da solução de lise estável
(próximo a 8,0), evitando ação de DNAses que poderiam
degradar o DNA.
3. NaCl – quebra ligações das cadeias peptídicas, auxiliando na
desnaturação de proteínas e promove a aglomeração do DNA.
4. EDTA – auxilia inibindo as DNAses.
 Extração de DNA
Separação dos constituintes celulares:

• Após a lise das membranas, o DNA é liberado na solução aquosa junto

com outros componentes celulares.
• A proteinase K fará a digestão de proteínas, auxiliando na separação do
DNA dos demais dos constituintes celulares
• Após a centrifugação, o DNA permanece na fase aquosa (sobrenadante),
e deve ser transferido para um novo tubo, sendo separado de proteínas
e demais componentes.
• A repetição dessa etapa pode elevar a pureza, entretanto pode resultar
em perdas de DNA.
 Extração de DNA
Precipitação do DNA

• Em baixas temperaturas e
elevada concentração salina
(NaCl presente no tampão de
lise), a adição de etanol absoluto
resulta na precipitação do DNA,
formando um aglomerado de
filamentos esbranquiçados que
podem ser visualizados no tubo.
 Extração de DNA

Lavagem e ressuspensão do DNA

• Geralmente a lavagem do DNA é realizada com etanol 70% para a

remoção dos sais, detergentes e de outras impurezas.

• Após a secagem por evaporação, o DNA é ressuspendido em água

ultrapura ou em solução tampão.
 Concentração e Qualidade
do DNA
Após a extração do DNA, muitas vezes, é
importante conhecer saber sobre o
rendimento e qualidade do produto antes
de utiliza-lo nas analises seguintes através
de dois métodos:

• Espectrofotometria
(concentração/pureza da amostra)
• Eletroforese
(qualidade/integridade da amostra)
 Espectrofotometria

• Técnica que utiliza a luz para medir as

concentrações de soluções.
• A interação da luz com a matéria permitirá
a realização diversas análises.
• Cada composto químico absorve,
transmite ou reflete luz ao longo de um
determinado intervalo de comprimento de
onda.
Espectrofotometria
Cubetas:

• Recipiente utilizado para

colocar o material que será
analisado.
• Podem ser de vidro, quartzo
(análise de DNA) ou plásticas.
• Cuidado ao manusear, pois
mesmo uma ligeira
impressão digital pode
interferir nos resultados.
cubetas
Espectrofotometria
• A concentração de
DNA será medida a
partir da quantidade
de luz absorvida no
comprimento de onda
de 260 nm.
• Quanto maior a
absorção de luz nesse
comprimento de
onda, maior a
concentração de DNA
na solução.
espectrofotometro
 Espectrofotometria

• Devido ao volume das cubetas, é

necessário diluir as amostras de
DNA para a realizar a medição.
• O fator de diluição deve ser levado
em consideração no cálculo da
concentração (veja a seguir).
• Existem aparelhos específicos
(nanodrop) utilizam apenas 1 μL
de amostra evitando a
necessidade do fator de diluição.

nanodrop
 Espectrofotometria
O cálculo da concentração do DNA nas amostras e realizado utilizando a
seguinte fórmula:
Concentração DNA (ng/uL) = Abs260nm × F.C. × F.D
Sendo:
• Abs260nm = absorbância da amostra em 260 nm (ver valor no aparelho)
• F.C = Fator constante – DNA=50; RNA= 40
• F.D. = fator de diluição
Ex: Amostra com 10uL de DNA em 990uL de H2O
Na maioria das vezes utilizamos essa diluição =)
 Espectrofotometria

• A espectrofotometria também é utilizada para a avaliação da

qualidade das amostras de DNA.
• Calculada a partir dos valores de absorbâncias medidos nos
comprimentos de onda de 260nm e 280 nm.

• Valores entre 1,4 e 2,0 indicam pureza adequada das extrações de DNA,
• Valores abaixo de 1,4 podem significar a presença de proteínas ou outros
contaminantes.
 Agora é sua vez...
Calcule a concentração e pureza das amostras 1 e 2:
Amostra 1:
Abs 260 nm = 0,038
Abs 280 nm = 0,034
Fator de diluição = 100 Lembrando que:
Fator constante = 50
Amostra 2:
Abs 260 nm = 0,065
Abs 280 nm = 0,035
Fator de diluição = 100
Fator constante = 50
 RESULTADO
Amostra 1:
Abs 260 nm = 0,038 Amostra 1:
Abs 280 nm = 0,034 Abs 260 nm = 0,038x50x100= 190
Fator de diluição = 100
0,038
Fator constante = 50 =1,11
0,034
Amostra 2:
Amostra 1:
Abs 260 nm = 0,065
Abs 260 nm = 0,065x50x100= 325
Abs 280 nm = 0,035
Fator de diluição = 100 0,065
Fator constante = 50 =1,85
0,035
 • Método de separação de macromoléculas, como DNA, RNA
e proteinas, em um gel, de acordo com seu peso molecular
por meio da aplicação de um campo elétrico.
Eletroforese • Quanto menor o tamanho da molécula, mais rápido será o
seu deslocamento no gel.

DNA = carga negativa  migra para polo positivo

 Eletroforese
A eletroforese em gel pode ser
realizada de forma horizontal ou
vertical.

Horizontal:
• Em gel de agarose, em um
recipiente (cuba) que
apresenta os polos positivo
e negativo e onde se
adiciona solução tampão
(TAE ou TBE).
• Separação de fragmentos de
50pb até 50Kb.
pb = pares de bases
1.000 pb = 1 Kb
 Vertical:
• Em gel de poliacrilamida, e cada polo da cuba esta em um
Eletroforese recipiente com tampão em níveis separados (o negativo
acima e o positivo abaixo), conectados pelo gel.
• Mais sensíveis, permitem a diferenciação de moléculas
com variações no tamanho de ate 1 pb.
 Eletroforese
Análise do gel:

• O resultado é visualizado
pela adição, ao gel, às
amostras, ao tampão de
corrida ou incubando o
gel após a corrida com
corantes fluorescentes de
alta afinidade pelo DNA.

transiluminador
 Eletroforese

Análise do gel:

Gel de agarose:
1) Brometo de etídeo – intercala-se
entre as fitas duplas, e que sob luz
ultravioleta (UV), emite
fluorescência alaranjada, formando
bandas visíveis nas regiões onde há
DNA; apresenta certa toxicidade
(cuidado ao manusear!)
Eletroforese

Análise do gel:

Gel de agarose:
2) GelRed, GelGreen e
SybrGreen – possuem
afinidade com DNA e
não são tóxicos.
 Eletroforese
Análise do gel:

Gel de poliacrilamida
1) Nitrato de prata –
liga-se ao DNA
formando bandas
escuras no gel.
 Eletroforese

Ao preparar as amostras para

pipetar no gel adiciona-se uma
solução tampão de migração
constituída de um açúcar, como
IMPORTANTE: glicerol, para dar densidade e
um corante, como o azul de
bromofenol, para visualização
durante a pipetagem e migração
no gel.
Referências Bibliográficas:
• ALBERTS, Bruces, JOHSON, Alexander, LEWIS, Julian, ROBERTS, Keith, WALTER,
Peter, RAFF, Martin. (04/2011). Biologia Molecular da Célula. 5ª edição. Porto
Alegre: Artmed.
• ALBERTS, Bruce, BRAY, Dennis, HOPKIN, Karen, JOHNSON, Alexander, LEWIS,
Julian, RAFF, Martin, ROBERT. (01/2015). Fundamentos da Biologia Celular. 3ª
edição. Porto Alegre: Artmed.
• LIPAY, Monica V. N; BIANCO, Bianca; Biologia molecular - métodos e interpretação
1. ed. - Rio de Janeiro: Roca, 2015.
• LODISH, H.; BERK, A.; MATSUDAIRA, P.; KAISER, C.A.; KRIEGER, M.; SCOTT, M.P.;
ZIPURSKY; DARNELL. Biologia Celular e Molecular. 5ª ed. Porto Alegre: Artmed,
2005. 1054p.
• BRUNO, A. N. (Org.). Biotecnologia II: aplicações e tecnologias. Porto Alegre:
Artmed, 2017.
 Estudo Dirigido
1) Liste e explique brevemente as etapas da extração de DNA.
2) Qual é a importância da realização da técnica de
espectrofotometria após a extração do DNA?
3) Qual é a importância da realização da técnica de
eletroforese após a extração do DNA?