Elisa Elisa direto
Características Gerais
 Ensaio imunoenzimático que permite
quantificar um determinado antígeno ou
anticorpo com alta especificidade e
sensibilidade, com rapidez e baixo custo.
 Amostra é soro ou plasma, amostra
límpida sem hemólise ou lipêmica.
Procedimento
 FASE SÓLIDA : É utilizada placa de
poliestireno, polipropileno, policarbonato ou
polivinil, com fundo plano. As placas de
poliestireno são mais utilizadas pois são
compostas de longas cadeias de carbono com
anel benzeno que a tornam hidrofóbicas.
Permite a ligação de inúmeras outras
moléculas.
 SENSIBILIZAÇÃO DA PLACA : Consiste
na adsorção (ligação) de antígenos ou
anticorpos no fundo dos poços da placa.
 BLOQUEIO DA PLACA : Etapa importante
para que estejam presentes na placa somente
a molécula de interesse. A adição de
substâncias com alta concentração de
proteína, como leite desnatado, albumina
sérica bovina, gelatina, caseína, soro fetal
bovino, impedem a ligação de outras
moléculas.
 Detecta antígenos ou anticorpos na
amostra do paciente.
 PRINCÍPIO DO TESTE: adição da
amostra do paciente contendo a molécula de
interesse (antígeno ou anticorpo) que se fixa
a placa, após lavagem, adiciona-se um
anticorpo conjugado a uma enzima, que se
liga ao antígeno presente no poço (do
paciente). Após lavagem, a adição de um
substrato faz com que
a enzima do conjugado reaja mudando a cor
dele.
Geralmente a enzima é a peroxidase e o
substrato é o peróxido de hidrogênio, ao
reagirem formar a tetrametilbenzidina que
possui coloração azul. Se o resultado não for
lido no momento, adiciona-se uma solução de
parada, que normalmente é um ácido ou uma
base forte, que muda a coloração para o
amarelo, no entanto mantém a intensidade.
 Em seguida o resultado é lido pelo
leitor de Elisa (um espectrofotômetro)
permitindo resultados quantitativos. Realiza a
leitura em transmitância e o resultado é
liberado em absorbância. A leitura é
convertida em números de acordo com a
curva padrão.
Elisa indireto
 Detecta anticorpos na amostra do
paciente.
 PRINCÍPIO DO TESTE : a placa é
sensibilizada por antígenos comerciais,
adição da amostra do paciente contendo
anticorpos faz com que eles se liguem ao
antígeno. Em seguida há adição de um
anticorpo anti-IgG humano conjugado a uma
enzima que se liga ao anticorpo do paciente.
A adição de um substrato faz com que a
enzima reaja mudando a cor do substrato, que
em seguida é medido pelo leitor de Elisa.
Quanto maior a absorbância maior a
concentração de anticorpos.
Elisa sanduiche
 Pesquisa de antígenos no soro do
paciente.
 PRINCÍPIO DO TESTE : A placa é
sensibilizada com anticorpos comerciais, com
a adição da amostra os antígenos se ligam aos
anticorpos ali presentes, em seguida
adiciona-se um anticorpo conjugada que se
liga ao mesmo antígeno, mas em epítopo
diferente (DIFERENTE ESPECIFIC IDADE) para
que não haja competição). A enzima do
conjugado reage com o substrato mudando a
sua cor
Elisa competitivo
 Detecta e quantifica antígenos ou
anticorpos.
PRINCÍPIO DO TESTE : deve ser realizada uma
pré incubação com amostra do paciente junto
com anticorpo específico para a molécula
pesquisada, a quantidade de anticorpo
adicionada em todas as amostras é a mesma e
o objetivo é que tenha em excesso. Na placa
contém a mesma molécula a ser pesquisada
na amostra, e ao adicionar o produto da pré
incubação, os anticorpos em excesso se
ligarão aos antígenos disponíveis. Após
lavagem, é adicionado um anticorpo anti-IgG
conjugado que liga aos anticorpos que
anteriormente estavam em excesso. Com a
adição do substrato a enzima do conjugado
reage e altera sua cor.
 Desta forma o resultado é inversamente
proporcional, quanto menor a absorbância
maior a concentração da substância no
plasma.

Sistema biotina-estreptavidina
 A biotina tem grande afinidade pelas
enzimas, portanto é usada para amplificar a
sensibilidade uma vez que permite o aumento
da quantidade de enzimas ligadas a um
anticorpo (mais de uma molécula é ligada ao
anticorpo conjugado).