UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI

CAMPUS CENTRO-OESTE DONA LINDU

BACHARELADO EM BIOQUÍMICA

Disciplina: Práticas em Biologia Molecular

Professor: Israel José Pereira Garcia
Técnico: Flávio Martins de Oliveira

RELATÓRIO 1
Extração, Precipitação e Dosagem de DNA

Allan Kardec Moreira de Aguiar

Ana Gabriela Finamore dos Santos
Higor Tavares Guimarães
Marcos Fernandes de Faria
Thaís de Castro Martins de Oliveira

Maio/2023
Divinópolis/MG
Introdução
A extração da amostra de DNA é uma etapa essencial para a realização de estudos
voltados à biologia molecular, podendo ser empregada em diferentes áreas como na química
forense, na realização de exames, como por exemplo, o PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase) e, também, na biotecnologia (WAKO, 2014).
A metodologia para realização da extração do DNA deve ser indicada de acordo com
a finalidade e o tipo de amostra de interesse (tecido, fluidos, células, etc). De um modo geral
a extração inicia-se na lise celular visando o rompimento da membrana plasmática e o
extravasamento do material genético, posteriormente, é realizado o isolamento e, por fim, a
purificação do DNA.

Objetivo
Extrair o DNA humano partindo da mucosa bucal do doador, demonstrar o processo
de lise celular, quantificação e purificação.

Metodologia
Para a realização da prática, foi coletada uma amostra da mucosa bucal de um dos
integrantes do grupo com o auxílio de um swab. Foram realizados movimentos circulares
durante o período de 1 (um) minuto e, posteriormente, emergiu-se a extremidade do mesmo
em um tubo Eppendorf contendo 1 mL de água deionizada e autoclavada. Em seguida,
agitou-se a amostra no vórtex, rapidamente, por 2 vezes. A amostra foi, então, centrifugada
em uma velocidade de 13.000 rpm por 5 minutos.
Após a centrifugação, o sobrenadante foi aspirado e descartado com o auxílio de uma
micropipeta p1000, deixando apenas o pellet no fundo do tubo. Com o auxílio da micropipeta
p200 foi adicionado 200ul da resina de chelex ao pellet que, em seguida, foi ressuspendido
com o auxílio da micropipeta e homogeneizado no vortex. A amostra foi incubada em banho-
maria a 100ºC durante 1 hora. Após a incubação, a amostra foi agitada novamente no vórtex
por duas vezes e centrifugada durante 10 minutos na velocidade de 13000 rpm.
Por fim, o sobrenadante resultante foi levado para ser lido no aparelho Nanodrop. Para
isso, ligou-se o aparelho, o programa foi aberto e a opção “ácido nucleico (DNA fita dupla)”
foi selecionada. Foi realizada a leitura do branco (água deionizada) e, após limpar o pedestal
do Nanodrop com uma gaze, foi adicionada uma gota do sobrenadante para a leitura. A
amostra foi lida em 230, 260 e 280 nanômetros.

Resultados e Discussões
 Para realização da quantificação do DNA, a água deionizada foi utilizada como
branco. Os resultados obtidos foram:
● Relação ABS 260/ABS 280=1,1 ng/μL
● Relação ABS 260/ABS 230= 0,42 ng/μL
● Concentração de DNA 119 ng/μL.
Sendo ABS 260 referente ao DNA, ABS 280 referentes a Proteína e ABS 230 referente a
Carboidratos, resina e fenol.

Quadro 1: Informações sobre os dados obtidos experimentalmente e aqueles sugeridos

para a realização do relatório.

Dados da primeira Dados da segunda análise

experimentação

ABS 260/ABS 280 0,32 ng/μL 1,1 ng/μL

ABS 260/ABS 230 4,00 ng/μL 0,42 ng/μL

Concentração de DNA 0,4 ng/μL 119 ng/μL

Fonte: Próprio autor

 A etapa de quantificação do DNA presente em uma amostra é importante pois permite
que padrões experimentais sejam criados, garantindo que, ao se repetir um experimento, uma
mesma quantidade de DNA seja avaliado o que, consequentemente, reduz erros de análises.
Na extração de DNA o valor de referência para relação ABS 280/ABS 260 é de 1.8
ng/uL à 2.0 ng/uL. Resultados dentro destes padrões significa que foi obtido DNA puro,
quando os valores são menores que 1.8 ng/uL pode significar uma possível contaminação
por excesso de proteínas, já uma concentração maior que 2.0 ng/uL pode representar uma
contaminação por excesso de RNA. Considerando que o resultado obtido na análise foi de
1.1ng/Ll é possível sugerir que a amostra utilizada estava contaminada com excesso
proteínas
O valor de referência para relação ABS 260/ABS 230 deve ser maior que 2.0 ng/uL,
ou seja, para ABS lidas entre 260 nm e 230 nm, onde o resultado é menor que 2.0 ng/uL
sugere-se que o DNA se encontra não puro com presença de carboidratos, resinas e/ou fenol,
ou está expresso em quantidades diminuídas. Observando os resultados obtidos, percebe-
se uma presença significativa de proteínas nas bandas de 260 nm a 280 nm (1.1 ng/uL); já
nas bandas de 260 nm a 230 nm (0.42 ng/uL) analisa-se pouca expressividade de DNA o que
pode ser explicado por algum erro na experimentação ou presença aumentada de lipídeos,
resina e/ou fenol.
A fim de melhorar os resultados obtidos, poderia-se utilizar na extração do DNA o Fenol-
Clorofórmio como agente capaz de desnaturar proteínas, reduzindo assim a contaminação
da amostra. Outra medida a ser adotada para alcançar melhores resultados, poderia ser o
método salting-out, que consiste em adicionar altas concentrações de solução salina para
aumentar a solubilidade e facilitar a precipitação de moléculas orgânicas. Uma vez que o DNA
permanece na fase aquosa e as demais moléculas orgânicas se solubilizam, a separação do
DNA se torna mais efetiva.

Considerações finais
Por fim, declaramos que os dados utilizados para a realização deste relatório foram
sugeridos pelo professor, uma vez que as concentrações de DNA obtidas durante a prática
não foram minimamente satisfatórias, fez-se necessário a manipulação destes dados para
continuação dos estudos.
 RELATÓRIO 2
PCR - Reação em cadeia da polimerase

Divinópolis, 2023
Introdução
O DNA é formado por duas fitas complementares, as quais podem ser facilmente
separadas em fitas simples ou desnaturadas, e, posteriormente, renaturadas, voltando ao
estado de fita dupla (Guerra ,2004).

A técnica laboratorial denominada Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é

empregada para amplificar ácidos nucleicos, permitindo a desnaturação e renaturação de
segmentos curtos de sequências de DNA ou RNA (Rames,1992; Lorenz, 2012). Tal processo
é realizado por meio da enzima DNA polimerase 1, derivada de um organismo chamado
Thermus aquaticus, conhecida como Taq DNA ( Rames,1992; Lorenz, 2012).

A PCR consiste em três fases principais : desnaturação, hibridização/anelamento e

amplificação (Rames, 1992) . Após a desnaturação do DNA e a hibridização dos primers ou
iniciadores com as fitas de DNA, a enzima DNA polimerase sintetiza o DNA na direção 3´
para 5 ́ produzindo filamentos idênticos aos filamentos da fita molde (Ghannam,2022).

Objetivo
Amplificação de uma sequência de DNA, através da identificação do gene fator V de
Leiden de amostra obtida da mucosa bucal.

Metodologia
Para determinação da quantidade do material genético extraído da mucosa bucal de
um dos integrantes do grupo “amostra”, utilizou-se o equipamento Spectrophotometer
Nanodrop, a concentração obtida de DNA bruto foi de 119 ng/μL.

A princípio para o desenvolvimento do experimento, se fez necessário calcular o

volume de cada componente necessário (primers 1 e 2, dNTP, tampão, MgCL2, enzima e
DNA), sendo que, o volume total da amostra seria de 20μl.

Tampão (1μM) Primers 1 e 2

10μM . v1 = 1μM . 20μl 10μM . v1 = 1μM . 20μl
v1 = 2 μl v1 = 2 μl

MgCL2 dNTP
50mM . v1 = 2,5mM . 20μl 50mM . v1 = 0,2mM . 20μl
v1 = 1 μl v1 = 4 μl

DNA Água
119ng . v1 = 10ng . 20μl 20μl (Vtotal) - 13,18μl (somatório de
v1 = 1,68 μl componentes)
v = 6,82μl
Tabela 1. Volumes dos componentes para PCR

Cálculos de volumes (μl)

Primer 1 2μl

Primer 2 2μl

dNTP 4μl

Tampão 2μl

MgCl2 1μl

Água 6,82μl

Taq 0,5μl

DNA 1,69μl

Volume Final 20 μl

Após a montagem da amostra com os cálculos dos volumes pré-estabelecidos acima

na tabela 1, a amostra foi encaminhada à centrífuga por aproximadamente 10 segundos.Com
o termociclador previamente ajustado às condições de PCR (num total de 30 minutos)
apropriadas para cada par de primers, os tubos foram inseridos no termociclador. Vale
ressaltar que foram utilizados controle positivo e controle negativo (contendo apenas os
reagentes da PCR).

A reação foi realizada com temperatura de desnaturação de 94ºC durante 5 minutos

e 30 ciclos de: 94ºC por 30 segundos; 59ºC por 30 segundos; 72ºC por 2 minutos, finalizando
com 72ºC por 5 minutos.
Resultados e Discussões
A PCR foi executada de maneira satisfatória possibilitando a verificação da ampliação
do gene fator V Leiden. Essa análise foi realizada via software, onde foi viável a visualização
da amplificação do gene de interesse.
 RELATÓRIO 3
Eletroforese em acrilamida não-desnaturante coloração e fotodocumentação

Divinópolis, 2023
Introdução
A técnica conhecida como eletroforese em gel de poliacrilamida , segue os mesmos
princípios da eletroforese em gel de agarose, entretanto, a matriz de poliacrilamida utilizada
apresenta poros menores, o que permite a separação de fragmentos menores, com tamanhos
máximos de 1kb (POSSIK, 2016).

Os géis de poliacrilamida são criados através da combinação de acrilamida e bis-

acrilamida (Bis) em conjunto com persulfato de amônia de tetratiletilenodiamina (TEMED),
ou riboflavina e TEMED, com o auxílio de luz ultravioleta ou fluorescente (Moreira & Garcia).
O princípio desse método baseia-se na carga negativa da molécula de DNA em valores de
pH neutro ou alcalino. Assim, quando o DNA é aplicado ou imerso em um gel submetido a
um campo elétrico, ele migra em direção ao pólo positivo (ânodo) (Silva,2020).

Objetivo
Através do uso da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), separar
uma amostra de proteínas, identificar e quantificar a quantidade de DNA e RNA que foram
obtidas na PCR da aula prática anterior.

Metodologia
Inicialmente foram preparadas as placas e a cuba onde a corrida foi realizada,
verificando a espessura dos pentes e dos espaçadores, que foram compatíveis. Usamos um
Padrão de Peso Molecular (PM) de 100pb ou 0-500 pb, e método de coloração com nitrato
de prata AgNO3.
Seguidamente se fez necessário preparar 10 mL de solução de gel, poliacrilamida a
8%, em um tubo Falcon de 15 ml, foi adicionado primeiramente 5,27 ml de água deionizada;
2,66 mL de bis-acrilamida; 70 μL de Persulfato de amônia ; TBE 5X e 1X Tampão 2 ml no
pH correto. Após a cuba de gel ser preparada com placas, pentes e espaçadores, o gel foi
inserido na cuba e em seguida adicionado 4 μL de Temed (catalisador), deixando
aproximadamente 15-30 minutos para a polimerização do gel, e, posteriormente, foi retirado
os pentes para a formação das canaletas. Com as canaletas já formadas, elas foram
submetidas a uma lavagem, e o gel foi adicionado na cuba.
Logo depois da adição do gel, a cuba foi preenchida com TBE 1X, e para garantir que
o DNA em solução aquosa alcance o fundo da canaleta preenchida com o tampão de corrida,
foi misturado ao gel com o tampão de carregamento um “peso” composto por glicerol , um
reagente denso para possibilitar que o DNA precipite no fundo do poço na canaleta. Foi feito
o mapa do gel aplicado às amostras com o carreador de amostras 6x nas canaletas.
Posteriormente, foi adicionado às amostras,na primeira canaleta o padrão de peso molecular
(PM) que vai de 100pb ou 0-500 pb, segunda canaleta controle positivo (CP), terceira canaleta
controle negativo (CN), na quarta canaleta grupo amostra , quinta canaleta grupo I (GI),
sexta canaleta grupo II (GII), sétima canaleta grupo III (GIII), e oitava canaleta o grupo IV
(GIV). O esquema na (figura-1) exemplifica o procedimento de pipetagem de uma amostra na
canaleta, e mostra o aparelho de eletroforese.

Figura 1. Esquema mostrando um aparelho de Eletroforese em gel de acrilamida não-desnaturante coloração . Adaptado de
Alberts et al., 2017.

Além disso, foram adicionados dois corantes para poliacrilamida não desnaturante, o
Azul de Bromofenol e o Xileno Cianol. Logo depois, o equipamento cuba vertical de
eletroforese foi conectado à fonte, e exposto a corrente constante de 100V por
aproximadamente 1h e 30 min. Após a corrida da eletroforese, os fragmentos foram revelados
com Nitrato de Prata, adicionando a quantidade até cobrir o gel fixador (etanol 10%; ácido
acético 1%), a qual, posteriormente, foi retirada e adicionado a solução de nitrato de prata
até cobrir o gel. Após a adição de cada solução foram feitas duas lavagens com água até o
aparecimento das bandas.
Resultados e Discussões
A Eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante, foi realizada com sucesso
e mostrou resultados para as amostras de DNA dos grupo amostra, grupo I, grupo II, e grupo
IV, e o padrão de peso molecular exibiu uma corrida no gel bem organizada e visualmente
atraente (Figura-2). Entretanto, o grupo (GIII) não apareceu nenhuma banda na corrida do
gel, isso pode ser causado por diversos fatores, talvez pode ser consequência de problemas
técnicos ocorridos durante a extração, ou quantidade insuficiente de DNA, entre outros.
Nesse caso, é necessário repetir a PCR, pois pode ter ocorrido a omissão de algum dos
reagentes essenciais ou até mesmo do próprio DNA.

Observou-se que o GAmostra e GIV apresentaram fragmentação em algumas

regiões semelhantes, o que indica possíveis fatores em comum que levaram a essa
ocorrência (figura-2). No entanto, é importante ressaltar que o grupo GIV também apresentou
fragmentação em locais distintos dos compartilhados com o GAmostra. Essa fragmentação
pode indicar possíveis problemas que podem ter ocorrido na etapa de extração ou na PCR.
Essa observação sugere a possibilidade de fatores adicionais específicos que podem ter
contribuído para essa parte que mostra uma fragmentação distinta da observada no
GAmostra.

A ausência de contaminação no controle negativo e a obtenção de uma corrida bem-

sucedida no controle positivo validam o protocolo experimental utilizado. A detecção das
bandas específicas nas amostras do GAmostra, GI,GII, e GIV de tamanho aproximadamente
de 250bp e no controle positivo, fornece uma informação valiosa para a caracterização e
comparação dessas amostras. A detecção dessa banda compartilhadas com o controle
positivo sugere que essa região específica do DNA está presente nessas amostras de
interesse.
Figura 2. Resultados da eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e revelação com Nitrato de Prata, indicando os padrões de
bandas amplificadas por PCR. bp=Pares de bases.PM= Padrão de Peso Molecular 100bp. CP e CN= controle positivo e controle
negativo. GAmostra = Grupo amostra. GI = Grupo 1. GII = Grupo 2. Glll = Grupo 3.GVI = Grupo 4.
RELATÓRIO 4
Eletroporação

Divinópolis, 2023
Introdução
A eletroporação é um tipo de promotor físico de permeação que consiste no
uso de pulsos curtos (microssegundos a milissegundos) de alta voltagem 100-1000
V/cm, os quais ultrapassam a barreira da membrana celular promovendo um
rearranjo estrutural desta membrana, e tornando-a altamente permeável a moléculas
exógenas(Vianna, 2011). A técnica de eletroporação ocorre quando um campo elétrico
pulsado é aplicado nas células em suspensão, promovendo a polarização da membrana e a
formação de nanoporos, e, aumentando assim, a permeabilidade celular ( Luft ,2015).
Durante esse período pode ocorrer a entrada de diversos compostos para o interior da célula,
como produtos químicos, medicamentos, RNA, DNA ou peptídeos ( Luft ,2015). Após a
passagem do pulso, a célula irá retornar ao seu estado inicial, recuperando sua integridade
celular ( Luft ,2015).
Esse rearranjo estrutural forma canais aquosos temporários (poros) devido a
aplicação do campo elétrico (Vianna, 2011). Esse fenômeno é um processo não
invasivo, reversível e não altera a estrutura biológica ou a função das células alvos
(Vianna, 2011). Os poros gerados são pequenos (< 10 nm), espaçados (0,1% da área
superficial) e de curta duração (μs a s) (Prausnitz,1993;Gehl,2003;Vanbever,2004).
A técnica de eletroporação pode ser utilizada em diversas áreas da biotecnologia e da
medicina (Rodrigues,2014). Por consistir em uma técnica que não é química e nem citotóxica,
ela pode ser utilizada para retirar ou inserir moléculas de uma célula (Weaver,1999;
Medi,2006). É uma área promissora na qual é utilizada no tratamento do câncer alinhado com
a quimioterapia convencional, promovendo a redução dos efeitos colaterais, como náusea,
fadiga e queda de cabelo (Rodrigues,2014).

Objetivo
Utilizar a técnica de Eletroporação para aumentar a permeabilidade e
desestabilização da bicamada fosfolipídica da bactéria Escherichia coli para inserção de um
vetor de expressão contendo o gene de interesse a ser clonado.

Metodologia
Inicialmente, preparou-se meio de cultura LB líquido utilizando-se NaCl, Peptona
bacteriológica e extrato de levedura em um béquer de 1L. Em seguida, completou-se com
800 mL de água destilada e aguardou-se a dissolução completa. Em uma proveta, completou-
se o volume para 1 litro. Acertou-se o pH para 7,2 e realizou-se a autoclavagem do meio.
Após 20 minutos, adicionou-se o meio ao banho a 56 ºC e aguardou-se atingir a temperatura
ambiente.
 Em seguida, preparou-se meio de cultura LB ágar (1,5%), utilizando-se 15g de ágar
por litro de meio LB, logo após, levou-se para a autoclave. Resfriou-se até 56 ºC. Ao atingir
uma temperatura em que fosse possível manusear a solução, no fluxo laminar, acrescentou-
se 1 mL de ampicilina a 100 mg/mL para 1 litro de meio de cultura e homogeneizou-se. Ainda,
dentro do fluxo laminar, adicionou-se o meio de cultura em placas de petri e aguardou-se a
solidificação do mesmo.
Para iniciar a eletroporação, preparou-se cubetas contendo alíquotas de
aproximadamente 30 a 50 µL de células de E.Coli.
Controle negativo: adicionou-se a cubeta com as células no eletroporador e realizou-
se a eletroporação, sem a adição de insertos.
Controle positivo: adicionou-se 1-2 µL de plasmídeo fechado em um eppendorf
contendo as células, e, em seguida, transferiu-se todo o conteúdo para uma cubeta e realizou-
se a eletroporação. Após este processo, adicionou-se 1 mL de meio LB sem antibiótico na
cubeta contendo as células eletroporadas, homogeneizou-se e transferiu-se para um tubo de
1,5 mL a fim de descansar as células do choque. Incubou-se os tubos em shaker sob agitação
durante 30-60 minutos a 37 ºC e a uma rotação de 360 RPM.
Após esse processo, realizou-se o plaqueamento das células a fim de resgatar as
bactérias transformadas com os insertos. Adicionou-se em diferentes cubetas contendo as
células de E.coli eletroporadas, insertos do tipo Pet-21 e Puc-18. Em seguida, plaqueou-se
as soluções contendo bactéria e inserto em meio de cultura sólido LB-ágar, contendo
ampicilina a fim de obter-se bactérias transformadas resistentes a este antibiótico. Plaqueou-
se também, o controle positivo e o controle negativo, o último apenas com células
eletroporadas em meio contendo antibiótico.

Resultados e discussões
Após os processos de eletroporação e transformação das bactérias, observou-se que
somente houve crescimento no meio que continha o inserto Pet 21 com UNG e no controle
positivo. Com isso, concluiu-se que houve transformação das bactérias com Pet 21 + UNG e
as mesmas cresceram na presença de ampicilina.
Como esperado, não houve crescimento bacteriano no controle negativo.
Observou-se a formação de bolhas nos meios de cultura solidificados nas placas de
petri, o que dificultou a visualização da possível formação de colônias como exemplificado na
figura 1.

Figura 01: Resultados das placas de petri inoculadas com bactérias E.Coli eletroporadas e transformadas, em meio de cultura
contendo ampicilina e os controles positivo e negativo.
Considerações finais
Ao final do experimento, chegou-se a conclusão que o processo de pipetagem e
transferência de solução entre as vidrarias, podem ter sido fatores que levaram ao não
crescimento nas placas contendo as bactérias transformadas. Deve-se levar em conta ainda,
o processo de eletroporação que pode ter lesado muitas células competentes fazendo com
que estas não tenham se recuperado até o momento do plaqueamento.
 RELATÓRIO 5
Miniprep (extração plasmidial) e Digestão

Divinópolis, 2023
Introdução
Os plasmídeos são moléculas de dupla fita de DNA extracromossomal que podem ser
passados entre células e, devido seu mecanismo de replicação independente, podem atribuir
às células hospedeiras novas características. Uma de suas utilizações consiste em
disponibilizá-lo como vetor para gerar células com resistência a antibióticos. O DNA
plasmidial é amplamente empregado na clonagem gênica, área que desperta interesse em
laboratórios de pesquisa genômica, genética e bioquímica.
Embora, muitos tipos de amostras possam ser utilizadas para extração, é importante
estar atento à sua escolha, uma vez que, a qualidade da extração depende da quantidade de
DNA de interesse que está presente na amostra. Atualmente, diversos laboratórios fornecem
kits prontos para a realização da extração de material genético que possuem vantagens como
menor custo, tempo e simplicidade da metodologia. (Perci, 1994)

Objetivo
Realizar a extração de DNA plasmidial (miniprep) e, posteriormente, a digestão do
DNA.

Metodologia
Para a realização do miniprep, foram adicionados 3 mL do meio de cultura ao LB+
ampicilina (100 uL/mL) durante o período de 16-18 horas sob agitação a 37°C e a 12.000
RPM. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 200 uL de TE com pH 8,0, a
ressuspensão foi homogeneizada utilizando uma pipeta até que o pellet fosse dissolvido.
Posteriormente, 200 uL de solução SDS/NaOH foram adicionados à solução, uma nova
homogeneização foi feita até que o pellet tivesse sido dissolvido.
Após incubação durante 5 minutos a 37 °C, a suspensão ficou transparente. Em
seguida, foi adicionado 150 uL de solução NaAc 3M com pH 4,8 e a solução foi misturada por
inversão até que se formasse precipitados. A solução foi submetida a centrifugação por 10
minutos e o sobrenadante resultante foi transferido para outro tubo.
Posteriormente, 1 mL de isopropanol foi adicionado ao sobrenadante e
homogeneizado cuidadosamente por inversão, a amostra foi incubada por 5 minutos a 37°C
e, depois, centrifugada a 4°C por 10 minutos. O sobrenadante resultante foi descartado e o
pellet foi lavado com 1 mL de etanol 75% gelado. A amostra foi então centrifugada a 4°C
durante 5 minutos, o pellet obtido foi seco e ressuspenso em 50 uL de água (Milli-Q).
Para a dosagem do DNA plasmidial foi utilizado o aparelho Nanodrop (280nm), para
isso o programa nanodrop 2000 foi programado selecionando a opção DNA dupla fita (ácido
nucleico). Antes da leitura da amostra, o aparelho foi zerado com 1 uL de água e o pedestal
foi limpo com uma gaze. O mesmo procedimento foi realizado para a leitura da amostra.
 A escolha da enzima para digestão do DNA foi feita de acordo com o manual do vetor
das enzimas de restrição a fim de identificar as enzimas que fazem o corte desejado e se
possuem tampões compatíveis. Para esta escolha, é importante saber a dosagem de DNA a
ser digerida.
As amostras de DNA a serem digeridas foram descongeladas e conservadas no gelo,
assim como as enzimas de restrição escolhidas e os tampões de cada enzima. Para que, o
nosso material genético fosse clivado em dois locais distintos (digestão dupla), foram
utilizadas duas enzimas no procedimento, a BxmHI (Bacillus amyloliquefaciens) e HIND III
(Xanthomonas axonopodis).
O banho maria foi ligado a 37°C e a reação de digestão foi realizada respeitando o
volume final de 20 uL em tubos eppendorfs de 0,5 uL, para isso foram utilizados:
● DNA(1000 ng)--------------15 uL
● Enzimas BamHI------------ 1uL
● Enzima HindIII-------------- 1uL
● 10x tampão ----------------- 2 uL
● Água (Milli Q) -------------- 1 uL
Por fim, os tubos foram fechados utilizando parafilme e deixados em overnight a 37°C.

Resultados e discussão
A extração plasmidial foi realizada com sucesso e a dosagem do DNA foi lida a 280
nm no Nanodrop. Através dos resultados expostos na figura 1 e sabendo que cálculos de
260nm/280nm determinam a pureza da amostra, sendo que,,os valores entre 1.4 e 2.0 são
considerados ideais em relação a pureza e valores menores que 1.4 descrevem
contaminação de RNA, podemos concluir que a amostra estava dentro do intervalo de pureza
aceitável.

Figura 1: Resultado da dosagem de DNA plasmidial obtido no experimento de extração.

 RELATÓRIO 6
Eletroforese em agarose

Divinópolis, 2023
Introdução
A eletroforese em gel de agarose é uma técnica amplamente utilizada em laboratórios,
ela tem o objetivo de separar as moléculas com base em seu tamanho molecular e pode ser
utilizada para separação de frações de DNA. Para isso, a malha do gel de agarose possui
poros por onde as moléculas de DNA migram sob estímulo de uma corrente elétrica, fazendo
com que as moléculas “cheguem ao final do gel” em momentos diferentes (Reece et al.,
2012).
Os dados obtidos após a corrida das moléculas de DNA no gel de agarose, podem
ser comparados com dados já elucidados na literatura, a fim de aumentar a confiabilidade e
qualidade do experimento (Reece et al., 2012).

Objetivo
Validar a digestão do plasmídeo e do inserto através da eletroforese em gel agarose.

Metodologia
Inicialmente, foi realizada a preparação do tampão de carregamento TEA (50x).
Posteriormente, o gel foi preparado utilizando 0,4g de agarose solubilizado com 40mL de TAE
(1x), a solução foi tampada com filme e aquecida no microondas por aproximadamente 5 min.
Após o líquido ter esfriado, ele foi despejado na cama e o pente foi colocado para a formação
das canaletas durante a solidificação do gel.
Após a solidificação, o gel foi colocado na cuba de eletroforese e coberto com tampão
TAE (1x). Foi realizada a remoção do pente e preparação da cuba, as amostras preparadas
na aula anterior foram adicionadas em cada canaleta e o gel foi submetido a corrida a 100V
durante 1 hora. Ao término da corrida, o gel foi colocado na cuba de coloração durante 30
minutos e, em seguida, levado ao transiluminador. A figura 1 representa o resultado da corrida
realizada.

Resultados e discussão
As enzimas de restrição clivam as moléculas de DNA permitindo que as mesmas
migrem de acordo com seus tamanhos. Vários padrões de migração podem ser observados
durante a corrida, o que fornece diferentes bandas em diferentes regiões do gel. Isto ocorre
devido às diferentes quebras e enovelamentos possíveis para os plasmídeos, levando ao
aparecimento de “padrões indesejáveis” que podemos caracterizar como contaminação.
Na figura 1, é possível observar as bandas formadas no experimento. Os resultados
demonstram que as bandas do padrão (canaleta 2) estão íntegras no gel. É possível observar
a presença de contaminação por RNA e conformações indesejadas de plasmídeos. A
contaminação por RNA é comum em experimentos nos quais não ocorre o tratamento com
RNAses, que é o caso desse experimento. As bandas plasmidiais entre 700 e 500 bp são
características da presença de insertos, entretanto, devido a presença da contaminação por
RNA nestas bandas, não é possível observar a presença de insertos. Outro motivo para o
não aparecimento dos insertos pode estar relacionada com a concentração da amostra, uma
vez que, os plasmídeos são maiores do que os insertos, eles podem ser vistos mesmo quando
os insertos não são visíveis.
Em relação a presença de plasmídeos, é possível observar o aparecimento de bandas
entre 4000 e 3000 bp, local de aparecimento das bandas plasmidiais, o que confirma sua
presença. Portanto, é possível concluir que a inserção do gene tanto quanto sua expressão
foram realizadas.

Figura 1: Resultado da corrida em gel agarose. Canaleta 2 apresenta o padrão.

Canaleta 3 apresenta o branco. Canaleta 7 e 11 não foram contempladas com amostras. Canaletas 4,5 e 6 apresentam 2uL de
PET21+inserto.Canaletas 8, 9 e 10 apresentam 4 uL de PET21+inserto. Canaleta 12 apresenta 10 ul de PET21+ inserto.
Canaleta 12 apresenta 10 ml de PET 21. Canaleta 14 apresenta 10uL de PUC18. Canaleta 15 apresenta 10uL de PEC21+
inserto sem digestão
Referências Bibliográficas
1- ALBERTS, B.; JOHNSON, A; LEWIS J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, A Biologia
molecular da célula. 6. ed. Porto Alegre: Artes Médicas, 2017.

2- Bio, Neo. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE. 2020. Disponível em:

https://www.neobio.com.br/blog/eletroforese-em-gel-de-agarose. Acesso em: 18/05/2023

3- FUJIFILM WAKO CHEMICALS U.S.A CORPORATION. 10 Métodos de Extração de DNA.

Disponível em: https://pt.wakolatinamerica.com/blog/post/10-metodos-de-extracao-de-dna/.
Acesso em: 20 março 2023.

4- Ghannam MG, Varacallo M. StatPearls [Internet]. StatPearls Publishing; Treasure Island

(FL): May 8, 2022. Biochemistry, Polymerase Chain Reaction.

5- Green MR, Sambrook J. Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harb Protoc. 2019 Jun
03;2019(6)

6-GUERRA, M. FISH, Conceitos e aplicações na citogenética. Sociedade Brasileira de

Genética, Ribeirão Preto, 2004.

7- Lorenz TC. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization
strategies. J Vis Exp. 2012 May 22;(63):e3998.

8- Luft C, Ketteler R. Electroporation Knows No Boundaries: The Use of Electrostimulation

for siRNA Delivery in Cells and Tissues. J Biomol Screen., 20(8): p.932-942, 2015.

9- MOREIRA,J.;GARCIA,G.R.Eletroforese.Disponível
em:https://www.fca.unesp.br/Home/Instituicao/Departamentos/Gestaoetecnologia/Teses/roc
a308.pdf Acesso em:19 mai.2023.

10- PERCI, Ricardo Delfini. Plasmídeos bacterianos. 1994. Disponível em:

https://ojs.revistasunipar.com.br/index.php/akropolis/article/view/1606/1388. Acesso em: 15
maio 2023.

11- POSSIK, P. A. A análise de DNA por eletroforese. 2016. Disponível

em:http://www.ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/biologia_molecular/testesgen
eticos.pdf Acesso em: 18 mai. 2023.

12- Prausnitz, M. R., Bose, V. G.; Langer, R.; Weaver, J. C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993,
90, 10504; [CrossRef] [PubMed] b) Gehl, J. Acta Physiol. Scand. 2003, 177, 437; [CrossRef]
[PubMed] c) Denet, A. -R.; Vanbever, R.; Préat, V. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004, 56, 659.

13-RAMESH, R.; Munshi, A.; Panda,S.K. Polymerase chain reaction. Natl Med J India, 1992
May-Jun;5(3):115-9.
14- Reece, J. B., Taylor, M. R., Simon, E. J., and Dickey, J. L. (2012). Figure 12.13. Gel
electrophoresis of DNA. Em Campbell biology: Concepts & connections (7th ed., p. 243).

15- RODRIGUES,G. Eletroquimioterapia para tratamento de câncer_desenvolvimento e

valiação em estudos de caso com camundongos portadores de melanoma B16F10 2014.
110f. Tese (Doutorado em Biotecnbologia) Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de
São Paulo,São Paulo,2014.

16- SILVA, A. C.S. Eletroforese em gel de Poliacrilamida como uma ferramenta importante
na análise da diversidade genética do subrupo willistoni de Drosophila. 2020. 49 f.
Dissertação (Mestrado em Saúde Humana e Meio Ambiente – Universidade Federal de
Pernambuco, CAV, Programa de Pós-graduação em Saúde Humana e Meio Ambiente, Vitória
de Santo Antão, 2020.

17- VIANNA,D.R.;SILVA,B.V.;HAMERSKI,L. Eletroporação e Iontoforese para Liberação de

Fármacos Através da Pele. Rev. Virtual Quim. v.2,p. 271-279,2011.

18- Weaver, J. C.; Vaughan, T. E.; Chizmadzhev, Y. Adv. Drug Deliv. Rev. 1999, 35, 21;
[CrossRef] [PubMed] b) Medi, B. M.; Singh, J. Int. J. Pharm. 2006, 308, 61.