PCR

Reao em Cadeia de Polimerase

IV CURSO DE VERO EM BIOLOGIA MOLECULAR E GENMICA MsC. Ingrid Thas Beltrame Botelho doutoranda ingridthaisbb@hotmail.com

PCR

O que PCR?
! Amplificao de um segmento especfico de DNA dentro de um genoma (gene ou parte dele, regies supervariveis, Junk DNA, etc.)

! Fotocopiadora molecular

Fonte: www.genomics.agilent.com!

Cpias in vitro usando elementos bsicos do processo de replicao natural do DNA.

nucleotdeos

PCR

! Inventada* por Kary Mullis em 1983.

! Primeira publicao em 1985 (Methods in Enzymology)

!Recebeu o Prmio Nobel de Qumica em 1993.

Em 2004...

Atualmente...

PCR

14983

2013: 3667

Ambiente adequado

PCR

Reagentes Necessrios para a Reao

! gua ! Tampo ! DNA molde ! Iniciadores* ! Nucleotdeos ! Mg++ ! DNA Polimerase (Taq)*

PCR

1989 - DNA Thermal Cycler, primeiro termociclador automtico

Ciclos de Temperatura
1. Temperatura de desnaturao do DNA

PCR

2. Temperatura de ligao dos iniciadores

3. Temperatura de extenso da fita de DNA

http://passel.unl.edu/pages/animation.php?a=PCR.swf

Desnaturao inicial: 4 minutos a 94C suficiente para a grande maioria dos casos. Desnaturao: 1 minuto a 94C Ligao: 1 minuto operando na temperatura de ligao especfica do primer, podendo ser aumentada at 90 segundos.

Extenso: Temperatura tima da enzima. Para a Taq, utiliza-se 1 minuto a 72C, podendo ser aumentada at 2 minutos de acordo com a quantidade utilizada, o nmero de ciclos e o tamanho do produto desejado Extenso Final: Aps o trmino dos ciclos, costuma-se acrescentar um passo de 4 minutos a 72C, como oportunidade adicional para a polimerase agir
Final: Programa-se o termociclador para um hold, de 0 a 4C, para manter as amostras conservadas at o momento de estocagem

PCR

Reagentes Necessrios para a Reao

! gua ! DNA molde ! Nucleotdeos ! Iniciadores* ! DNA Polimerase (Taq)* ! Tampo ! Mg++

Reagentes Necessrios para a Reao

! DNA molde
! Quantidade mnima de DNA ! Complexidade do DNA
! De plasmdeos a genomas completos

! Pureza
! Protenas, lipdeos, outro DNA, reagentes extrao

! Degradao ! Inibidores - EDTA, heparina ! Contaminao

! Produtos amplificados

PCR

Dissolvido em gua (deionizada estril) tampo (TE = Tris-EDTA; HEPES; NaOH 0,8M em gua, etc.) estoc-lo por longos perodos de tempo

20C - por at 2 anos em tampo apropriado.

Desoxinucleotdeos dNTPs

PCR

(dATP, dTTP, dCTP, dGTP)

!Soluo estoque de 10mM em gua e pH 8,1* sem pirofosfato
! Em

concentraes iguais*

! Concentrao

final entre 20 e 200!M, dependendo do tamanho do segmento e durao da reao

! Altas

concentraes afetam especificidade dos iniciadores

Inciadores / oligonucleotdeos/ primers

Reagentes Necessrios para a Reao

Complementar a seqncia do DNA molde 15 a 30 pares de base* Contedo de C/G 45 a 55%* Normalmente sense e antisense/ Foward e reverse Concentrao tima 0,1 a 0,5M

Considerar:
! Validade ! Nmero de congelamentos e descongelamentos ! Contaminao ! Quantidade
! Pouco: pouca amplificao ! Muito: pouca amplificao

PCR

(c) Evitar las secuencias repetidas

5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3 5-NNNNNNNNNNNNNTATA-3

3 repetido
5 3 3

Desenhando Iniciadores
5

5-NNNNNNNNTATA-3 3-ATATNNNNNNNN-5

Primer-Dimers (anelamentos Sense/Antisense),

Facultad de Farmacia y Bioqumica, UBA

PCR

5 Evitar las secuencias 3 repetidas (c)

5-TATANNNNNNNNNNNNN-3 5-TATANNNNNNNNNNNNN-3

5 repetido
3

Dmero de primer
5

5-TATANNNNNNNN-3 3-NNNNNNNNATAT-5

5 Self-Dimers (anelamentos ou Antisense/Antisense) PCR 3 Sense/Sense

Facultad de Farmacia y Bioqumica, UBA

(c) Evitar las secuencias repetidas

5 3
5-NNNNNNNNNNNGCA 3-CGT

5-NNNNNNNNNNNGCATGC-3 3 5 5-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3

Hairpins (dobramentos da cadeia de um primer , fazendo com que 5 PCR 3 ela se pareie consigo mesma).
3 5 5 3

extensin Formacin no de hay horquillas

Productos de PCR no deseados

Fonte: http://www.lgcm.icb.ufmg.br/software/cursoBionumerics/Confeccao_oligonucleotideos_iniciadores.pdf

Taq DNA polymerase

PCR 5 ! 3 / sem atividade corretiva!

Thermus aquaticus

Thomas Brock - 1976

Estvel at 117C

Taq DNA Polimerase

0,4 a 1U da enzima para reaes de 25l finais. "! Para reaes longas usar mais enzima ou escolher mais estvel "! Em geral so forenecidas conjuntamente com soluo-tampo especfica, cuja composio varia com o fabricante.
"!

Non-Proofreading
!alguns erros na seqncia do fragmento final.
! adiciona

PCR

uma adenina (A) extra s extremidades 3 do DNA **

Proofreading
!!no adicionam nucleotdeos extras nas bordas das cadeias-filhas !!Com atividade corretiva 3 ! 5
Pfu (de Pyrococcus furiosis) e a Tli (de Thermococcus litoralis) Promega, Gold da PerkinElmer, Platinum da Life-Technologies, Vent da New England Biolabs, Pwo polimerase da Boehring.

PCR

"!

Ao usar proofreads usar maior concentrao de dNTPs (mnimo 200M de cada) para evitar destruio dos iniciadores.

"!

A incorporao de bases erradas (mismatch)em enzimas sem atividade corretiva reduz a estabilidade da interao enzima com o DNA molde, o que pode favorecer a interrupo da polimerizao

Cuidar com Mg2+ e dNTPs!

Inibidores da enzima Taq DNA polimerase

Fenol "! Proteinase K "! Agentes quelantes em excesso (EDTA) "! Hemoglobina "! SDS "! Elevadas concentraes de sal
"!

PCR

Soluo-tampo
* ons diversos (Na+, Cl-, K+, entre outros) * Detergentes (Tween 20, Triton X-100, Nonidet P-40) * Protenas estabilizantes (BSA) * Substncias que agem na denaturao da cadeia molde de DNA (DTT = Dithiothreitol, !mercaptanoethanol), quebrando as pontes de hidrognio entre as bases.

PCR

Matriz dos 12 Tampes utilizados na otimizao das reaes de PCR

Tampo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tris-HCl pH 8,3 5mL (100mM) 5mL (100mM) 5mL (100mM) 5mL (100mM) Tris- HCl pH 8,8 5mL (100mM) 5mL (100mM) 5mL (100mM) 5mL (100mM) Tris-HCl pH 9,2 MgCl2 750!L (15mM) 750!L (15mM) KCl 12,5mL (250mM) 37,5mL (750mM) 12,5mL (250mM) 37,5mL (750mM) 12,5mL (250mM) 37,5mL (750mM) 12,5mL (250mM) 37,5mL (750mM) 12,5mL (250mM) 37,5mL (750mM) 12,5mL (250mM) 37,5mL (750mM)

Ateno!
5mL (100mM) 5mL (100mM) 5mL (100mM) 5mL (100mM)

1750!L (35mM) 1750!L (35mM) 750!L (15mM) 750!L (15mM)

Concentraes de KCl maiores que 50mM inibem a atividade das polimerases)

1750!L (35mM) 1750!L (35mM) 750!L (15mM) 750!L (15mM) 1750!L (35mM) 1750!L (35mM)

Adaptado do kit Opti-Primer - Stratagene (Califrnia)

PCR

Mg2+

! Co-fator essencial para a atividade da Taq DNA polimerase ! EDTA altera concentrao do magnsio livre na reao ! Quantidade pode variar:
! 0.5 a 3.0 M sugerido ! Muito pouco: Taq no trabalha ! Muito: mispriming, primersdimers

Curso UNIVILLE

PCR

Reagentes Necessrios para a Reao

!Extras

! Glicerol, DMSO (Dimetilsulfxido)

! 0,1 a 10% na reao

- Estabiliza Taq, - Ajuda na denaturao das fitas DNA ! Algumas Taq j vem adicionadas com ele ! BSA

Curso UNIVILLE

PCR

Parmetros a serem avaliados se algo der errado

Quantos ciclos?
Desnaturao a que temperatura? Quanto tempo? ! Taq perde atividade em altas T C:
! Meia-vida a 95C: 40 min ! Meia-vida a 97.5C: 5 min

PCR

! Temperatura de Ligao dos Iniciadores

! Baseia-se na Tm padro ! Tentativa e erro
! Muito alta: nenhum produto ! Muito baixa: produtos inespecficos

! Gradiente de temperatura ! Necessrio principalmente nos primeiros ciclos

PCR

Gradiente de Temperatura
TM

SC61

SC58

Macias

Macias

Choachi

H8GS

D3493

Palma 2

Palma 2

H14

Caneleta TC

1
45,9

2
46,7

3
48

4
49,9

5
52,1

6
54,4

7
56,9

8
59,3

9
61,4

10
63

11
64,2

12
65

PCR

O que fazer?
! Hot-Start PCR
! Taq adicionada somente aps passo de desnaturao inicial

! Touchdown PCR
! Temperatura de ligao dos iniciadores reduzida progressivamente

PCR

Mais Ciclos = Mais DNA

Size! Number of cycles! Marker! 0 10 15 20 25 30!

PCR

Tipos de reao de PCR

PCR

PCR Multiplex
! Mais de um segmento genmico amplificado numa nica reao, cada um com seu par de primers especfico.
Onde usar? Investigao de paternidade Diagnstico de doenas Identificao de transgnicos

PCR

Multiplex PCR:
! Detecta vrios genes de uma s vez ! Identificao de trnasgnicos ! Controle interno

PCR

PCR Multiplex : Exemplo

! Trs pares de iniciadores

Effect Gene Marker Gene Control Gene

Qual o transgnico?

Nested PCR
Duas etapas (rounds) de amplificao

PCR

concomitantemente ou em duas reaes separadas

Semi-Nested PCR Melhorar especificidade e eficincia da reao

PCR

RT-PCR (Reverse Transcriptase Chain Reaction):

RNA, que convertido em cDNA (DNA complementar)

PCR

Ferramenta til em estudos de expresso gnica

PCR

PCR

Por que usar PCR?

! PCR pode amplificar quantidade incrvel de DNA (visvel em gel de eletroforese) em ~2 horas. ! Trabalha com amostras mnimas de DNA, extradas de pequenas quantidades de sangue, pele, folculos pilosos, esperma, culturas ou at mesmo de fragmentos de fsseis ! O produto de PCR pode ser digerido com enzimas de restrio, sequenciado ou clonado.

PCR

Aplicaes
Diagnstico de infeces: bactrias, vrus, fungos, protozorios Quantificao de DNA ou RNA viral/clula hospedeira Diagnstico de mutaes gnicas Diagnstico de doenas genticas Estudo da expresso gnica: deteco e quantificao de RNA em: diferentes tipos celulares ao longo do desenvolvimento

PCR

Aplicaes
Engenharia Gentica Diagnstico de paternidade Medicina Forense Seqenciamento de DNA

PCR

Amplificao do gene do spliced-leader de diferentes cepas de Leishmania spp.

MW

H-1

H-2

H-3

H-4

La

Lb

bp 587 458 298 236 Grisard et al., 2000

Lc

NC

PCR

PCR

Identificao de mutaes pontuais atravs da eliminao/criao de stios de restrio e gerao de fragmentos de digesto com polimorfismo de comprimento a partir de produtos de PCR (PCR/RFLP).

PCR

RAPD PCR
Randomly Amplified Polymorphic DNA
Uma PCR com um primer s...e amplificando qualquer DNA Primer (10 a 15 bases) Temperatura de pareamento ou annealing < 45C Nmero de bandas superior a 4 e polimrficas (isto , com diferentes migraes) para indivduos diferentes

PCR

PCR

O RAPD permite no apenas discriminar entre populaes diferentes de organismos, mas inferir sua correlao filogentica