Análise da expressão gênica

RT-PCR
CONDIÇÃO
Exemplo: células de músculo
Coleta dos tecidos
Oryza sativa
Passo 1:
Foi feita uma pesquisa sobre genes de resistência para essa espécie

Passo 2:
Pesquisou-se nas bases de dados se o gene está descrito para a espécie
Caso não esteja, será objetivo isolar este gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Passo 3: Desenho de primers para amplificar a sequência
correspondente ao fragmento que se pretende isolar.

Para tal selecionam-se nas bases de dados as ORFs

(Open Reading Frames), ou seja, a região codificadora da
proteína.

Passo 4:
Isolamento de RNA total do organismo do qual se
pretende isolar a ORF
(espécie Oryza sativa)
 Extração de RNA total

• A integridade do RNA é
avaliada em gel de agarose
onde devem ser visíveis
duas bandas mais fortes
correspondentes ao RNA
ribossomais (28S e 18S)

• Obs: pode ocorrer

contaminação com o DNA
 Síntese de cDNA

• A técnica de Transcrição Reversa, que permite

converter este RNA em DNA complementar ou
(cDNA).
Transcrição Reversa
Síntese de cDNA
• O DNA complementar (cDNA), isto é, a fita de
DNA sintetizada pela transcriptase reversa a
partir do molde de RNA, corresponde à forma
mais conveniente de se manipular a sequência
de codificação do RNA mensageiro (RNAm),
isto porque o RNA é uma molécula facilmente
degradada por enzimas denominadas RNases
 Para a síntese do cDNA é necessário:

• o molde de RNAm

• desoxirribonucleotídeos trifosfatados, dNTPs

(dGTP, dCTP, dATP e dTTP)

• A enzima Transcriptase reversa

• oligonucleotídeos iniciadores,
 Diferentes de primers são usados para a
síntese de cDNA:

1) No caso de RNAm de eucariotos que possuem uma

cauda poli-A, é utilizado um primer denominado
oligo-dT, que contém 20 nucleotídeos

2) Outra opção pode ser uma sequência de

oligonucleotídeo específica para o RNAm alvo
 RT-PCR
• O cDNA será utilizado como molde para uma
PCR utilizando primers específicos para a ORF

• Espera-se que ocorra a amplificação do

fragmento que corresponde a ORF da
ORIZACISTATINA – I

• Se houver amplificação, esse gene está sendo

expresso em determinada condição ou tecido.
 PROTOCOLO TRATAMENTO DO RNA COM A
ENZIMA DNAse I
REAÇÃO:
• RNA: 10µL
• tampão da DNAse (10x): 2µL
• DNAse : 1 ul
• água tratada com DEPC: 7µL
———————————————
volume final da reação: 20 µl

 Incubar a reação por 15 minutos a 37°C ( termobloco)

Para inativar a DNAse adicionar 1µL de EDTA (25mM)
Aquecer a 65°C por 10 minutos.
 Protocolo síntese cDNA
Parte 1: RT-PCR

Reação preliminar:
10 l RNA
1 l primer OC-I 10 pmol/l (reverso)
água 4 l (p/ total de 15 l)

Manter a 70o C por 10 min. Depois colocar em gelo.

Síntese do cDNA: 15 l da reação de preliminar

6 l tampão 5X da RT (transcriptase reversa)
8 l dNTP 1,25 mM
1 l enzima RT (MMLV- Moloney Murine Leukemia Virus)
(volume final 30 l)
Manter a 42 o C por 30 min.
 RT-PCR

Parte 2: PCR: 2,5 l da reação de cDNA (1/10 da reação de cDNA)

8 l dNTP 1,25 mM
5 l tampão 10x
1,5 l MgCl2
1 l primer OC-I 1 10 pmol/l (direto)
1 l primer OC-I 1 10 pmol/l (reverso)
0,5 l Taq DNA polimerase
33 l água (p/ volume total de 50 l)

Condições de amplificação: 94o C, 1 min

35 ciclos de: 94o C, 1 min
47o C, 1 min
72o C, 1,5 min