PCR e PCR em Tempo Real

Conceitos básicos e concepção dos testes moleculares da Roche

 Ácidos nucleícos

• Existentes em todas as formas de vida (bactérias,

fungos, vírus, plantas e animais)

• Responsáveis pelo armazenamento e

transmissão da informação genética

• São importantes em várias ciências como:

engenharia genética, bioquímica, Biologia celular
e molecular (diagnóstico molecular de doenças)
Ácidos nucleícos
 Macromoléculas
quimicamente compostas
por nucleotídeos

 Nucleotídios compostos
por: bases nitrogenadas
açucar pentose, grupo
fosfato

 DNA & RNA

 DNA: O código da Vida

• Todos os organismos vivos partilham a mesma estrutura e as mesmas 4

letras do código genético
• Adenina, Guanina, Timina, and Citosina, que se emparelham nas cadeias
complementares A-T e C-G.
Adenine Guanine

Cytosine Thymine

Roche Molecular Diagnostics Version1.0

February 2004
• A estrutura de dupla hélice do DNA é
composta por
– Molécula de açúcar
– Grupo fosfato
– E uma base azotada (A,C,G,T)

• Para a transcrição, o DNA é sempre

lido do terminal 5’ para o terminal 3’
5’ ATTTAGGCC 3’
3’ TAAATCCGG 5’
Ácidos nucleícos
Di fere ça D NA & RN A

Di fe r e n ç a s e n tr e os ác i do s nuc leí c o s (DN A&R NA )

DNA RNA
 

Pentose Desoxirribose Ribose

Bases púricas Adenina e Guanina Adenina e Guanina
Bases pirimídicas Citosina e Timina Citosina e Uracila
Estruturas Duas cadeias Helicoidais Uma cadeia
Enzima hidrolítica Desoxirribonuclease Ribonuclease (RNAase)
(DNAase)

Origem Replicação Transcrição

Enzima sintética DNA - polimerase RNA - polimerase
Função Informação genética Síntese de proteínas
PCR - Amplificação de uma
sequência alvo específica
Seq. alvo

Cadeia de DNA

Dupla hélice

Cromossoma
Cadeia de DNA
superenrolada
(supercoiled)
 Workflow amplificação de ácidos
nucleicos
Detecção
Qualitativa

Extracção e Purificação RT-PCR Quantificação

de Ácidos Nucleicos (para RNA)
PCR

Outras análises
(p. ex. sequenciação)
Aplicações de Diagnóstico

Detecção de DNA/RNA de agentes infecciosos em amostras

clínicas: diagnóstico de infecção, rastreio de dádivas de sangue

Quantificação de DNA/RNA de agentes infecciosos em amostras

clínicas: monitorização da evolução da doença, monitorização da
eficácia terapêutica.

Análise do DNA Humano: Detecção de mutações causadoras de

doença ou de predisposição ao desenvolvimento de doenças,
alterações genéticas responsáveis pela variabilidade de resposta a
medicamentos
 Workflow amplificação de ácidos
nucleicos
Detecção
Qualitativa

Extracção e Purificação RT-PCR Quantificação

de Ácidos Nucleicos (para RNA)
PCR

A obtenção de ácidos nucleicos de

Outras análises
boa qualidade, isentos de inibidores (p. ex. sequenciação)

e com elevado rendimento é

essencial para a fiabilidade dos
resultados da análise de PCR.
 Tecnologia das esferas magnéticas

Amostra Lise Celular Ligação Separação Remoção dos debris celulares Eluição
Tampão de Lise dos A.N. às partículas (magnética) Por lavagens sucessivas e separação Temperatura elevada
Proteinase K magnéticas (MGP’s) dos complexos Conc. baixa de sais
(N.A.-MGP’s)
 Workflow amplificação de ácidos
nucleicos
Detecção
Qualitativa

Extracção e Purificação RT-PCR Quantificação

de Ácidos Nucleicos (para RNA)
PCR

• A reacção de PCR necessita de um “molde” de

Outras análises
DNA. (p. ex. sequenciação)
• Assim, caso o nosso material de partida seja RNA
(por ex. HIV), temos necessidade de um passo
intermédio de transcrição reversa, utilizando uma
Transcriptase Reversa, originária dos retrovírus.
Reacção de Transcrição Reversa
 Workflow amplificação de ácidos
nucleicos
Detecção
Qualitativa

Extracção e Purificação RT-PCR Quantificação

de Ácidos Nucleicos (para RNA)
PCR

• Consiste na multiplicação de moléculas de DNA “in

Outras análises
vitro” de forma a tornar possível a sua detecção e (p. ex. sequenciação)

análise.
• Baseia-se no princípio da replicação do DNA que ocorre
sempre que uma célula se divide e necessita de duplicar
o seu material genético
 Príncípio do PCR
Passo 1:

Desnaturação do DNA por aumento da

temperatura (> 90ºC)

• Dado que as ligações de Hidrogénio que ligam os

dois pares de bases são relativamente fracas, elas
quebram a temperaturas elevadas.

• Pelo contrário, as ligações entre a desoxiribose e

o fosfato, que constituem o “esqueleto” da cadeia,
são ligações covalentes fortes, pelo que
permanecem intactas
 Príncípio do PCR
Passo 2 :

Ligação (hibridação) dos primers ao DNA alvo (temp. 40ºC a 65ºC)

• O objectivo do PCR não é replicar a cadeia completa do DNA, mas apenas o

fragmento (de 100 a 35.000 pb) que interessa para a nossa análise.

• Durante o passo de hibridação ou Annealing, os primers ligam-se às

sequências homólogas que encontra na molécula alvo.

• Os primers são pequenas sequências sintéticas de DNA em cadeia simples,

tipicamente com 20 a 30 nucleótidos.

• Este passo ocorre normalmente com temperaturas entre 40ºC e 65ºC,

dependendo do comprimento e da sequência dos primers.

• A escolha adequada da temperatura assegura a hibridação dos primers

apenas quando encontra complementaridade absoluta, definindo assim a
especificidade da reacção
 Príncípio do PCR
Passo 3:
Extensão dos primers com polimerase
termoestável (temp 68ºC- 72ºC)

• Após a ligaçao dos primers, a temperatura é

aumentada para 68ºC-72ºC e uma polimerase
termoestável (por ex. Taq DNA polimerase) inicia a
síntese de novas moléculas de DNA em cadeia dupla,
idênticas ao alvo original.

• Esta subida de temperatura, permite a manutenção

da especificidade da reacção, daí a importância da
descoberta das polimerases termoestáveis.
Passo 1 - Desnaturação
Sequências emparelhadas são desnaturadas
aquecendo a 95°C

Sequência Alvo

Sequência Alvo
Passo 2- Hibridação (Annealing)
Primers específicos ligam-se à extremidade 3’ da
sequência alvo em cada cadeia.
Temperatura de 40° a 65°C
Sequência alvo
3’
5’
5’
3’
Primer 1
Primer 2

3’
5’
5’
3’
Sequência alvo
Passo 3- Extensão ou elongação
DNA polimerase termo-estável elonga a cadeia a partir da
extremidade 3’ dos primers a 72°C
Sequência alvo
3’
5’
5’
3’
Primer 1
Taq DNA
Polymerase
Primer 2
3’
5’
5’

3’
Sequência alvo
Após o primeiro Ciclo
Existem duas cadeias “mães” e duas cópias.
As cópias da sequência alvo denominam-se Amplicon
Sequência alvo

Cópias

Sequência alvo
Measurement Sequence
Após dois ciclos
 Após Três Ciclos

• O comprimento da sequência amplificada é determinada pela

posição dos primers
 Após vários ciclos

A PCR é um processo
exponencial.
Teoricamente, o número
de cópias duplica em
cada ciclo

Na realidade a evolução das

cópias é sigmoidal:
Aumenta exponencialmente
Copies

até exaustão de primers e de

outros componentes
Cycles
 Amplificação por ciclo
No. of Cyc le s No. of Targe t Amplic ons

1. cycles = 2 amplicons 1 2
2. cycles = 4 amplicons
2 4
3. cycles = 8 amplicons
3 8
4. cycles = 16 amplicons
4 16

5. cycles = 32 amplicons 5 32

10 1024
6. cycles = 64 amplicons
20 1,048,576 (1.0 E6)

30 1,073,741,824 (1.0 E9)

7. cycles = 128 amplicons
37 137, 438, 953, 472 (1.3 E11)

40 1,099,511,627,776 (1.1 E12)

 Componentes da reacção
• Enzima: Polimerase termoestável
• Tampão de PCR adequado (com ou sem aditivos)
• MgCl2 (algumas polimerases poderão utilizar Mn 2+
em vez de Mg2+ )

• Desoxinucleótidos (dNTPs)

• DNA alvo
• Primers específicos da sequência a amplificar
 Master Mix

Cofactor enzimático:
2+ Polimerase
Mg2+ or Mn

Tampões
dCTP
AmpErase®
dGTP
dUTP
dATP Primers
 Prevenção de contaminações
por produtos de amplificação

 Problema:
Contaminação de Produtos de PCR (de DNA
previamente amplificado)
 Resultados falso-positivos

 Solução:
Utilizando Uracil-DNA N-Glycosylase (UNG) é
possível eliminar contaminação por “carry-over” de
produtos amplificados
 Prevenção de contaminações
3’ATTCGGCCATTAGA GCCTAGTCG 5’
TAGCCAGTAATAGCACCTAG
5’AGCCGGTAATCUCGGAUCAGCAUCGGUCAUUAUCG
3’
Utilizando dU em vez de dT na reacção, os amplicons
podem ser quebrados pela UNG

3’ 5’
UCGGCCAUUAGA GCCUAGUCGUAGCCA
GUAAUAGC
AGCCGGTAA TCUCGGAUC A
5’A 3’
GCAUCGGUCAUU
AUCG
UNG

Na próxima reacção de amplificação, a mistura é tratada com UNG +

aumento de temperatura para a inactivar
 Os fragmentos já não podem servir de molde para
PCR subsequentes
 Selective Amplification using AmpErase ®

Specimen/Target DNA Unmodified Specimen/Target DNA

AmpErase®

Carry-Over Amplicon DNA Inactivated Amplicon DNA

Unmodified Specimen/Target DNA
Heat,
Alkaline
pH
Inactivated
AmpErase®
enzyme

Inactivated Amplicon DNA

Roche Molecular Diagnostics Version1.0
February 2004
 Workflow amplificação de ácidos
nucleicos
Detecção
Qualitativa

Extracção e Purificação RT-PCR Quantificação

de Ácidos Nucleicos (para RNA)
PCR

Outras análises
(p. ex. sequenciação)
Monitorização das reacções de PCR
De termocicladores convencionais a
Real-Time PCR
 PCR em Tempo Real

• Fluorescência

• Técnicas de Detecção
– Sondas de Hidrólise
– Sondas de Hibridação
– SYBR Green
 Sondas de Hidrólise

R Q G
G
G G
A C T G A C T G A T A T

Sondas oligonucleotídicas específicas para a sequência alvo e para o CI com corante sinalizador
fluoresceste
Quando se inicia a reacção, as sondas de hidrólise têm as moléculas “Reporter” (sinalizador) e
“Quencher”(supressor) ligadas uma à outra pela cadeia de DNA . Quando estas sondas estão
intactas a fluorescência do corante sinalizador é suprimida pela proximidade da molécula
suppressora.
Após a quebra da sonda
T
A

G
T

G Q
G
A T
C
T A T
T
G R A
G G
T G
T
C T
A T

Após a quebra da sonda, a molécula Reporter fica distante da Quencher, pelo que a fluorescência
emitida não é absorvida, podendo por isso ser detectada.
Detecção baseada em Sondas
de Hidrólise (ou TaqMan)

Desnaturação Annealing Extensão Fim da Extensão

Polimerase com actividade Leitura da Fluorescência
5’- exonuclease, degrada a
sonda, separando-a do
quencher
TaqMan Probe Assay Principle
®
 Espectros de Absorção/Fluorescência

Um composto absorve luz em vários comprimentos de onda

(azul) e emite fluorescência em vários comprimentos de onda
(verde).
 Filtros e PCR em Tempo Real

• A fonte de luz branca do

equipamento é filtrada por forma a
optimizar a absorção, com um Filtro
de Excitação Espectro Espectro
de Absorção de Fluorescência

• O equipamento filtra também a luz

proveniente da reacção com um
Filtro de Emissão para assegurar
que apenas se detecta a luz emitida
pelo composto em estudo
COBAS® TaqMan® / TaqMan® 48

COBAS® TaqMan® COBAS® TaqMan® 48

• PCR Amplification & Real-time Fluorescence Detection

Sistema Óptico COBAS® TaqMan®
COBAS® TaqMan® / TaqMan® 48 Analyzer
Fluorometer

excitation sample
filter

emission
filter

light source
detector
COBAS® TaqMan® / TaqMan® 48 Analyzer
Alignment of Fiber Optic Bundles

K-tube

Excitation Fiber Emission Fiber

Optic Bundle Optic Bundle

Excitation Ray 90° Emission Ray

 Cinética do PCR
• Com PCR em tempo real podemos
Teoria seguir o aparecimento de moléculas
Amplicons (Fluorescencia)

amplificadas, ciclo a ciclo, pelo que é

também denominado Kinetic PCR
• No entanto, a cinetica de uma
Reality amplificação quando colocada em
gráfico, apresenta um perfil sigmoide,
parecido com uma curva de
crescimento bacteriano
• Embora a realidade pareça
contradizer a teoria, a verdade é que
o PCR é um processo enzimático e,
como tal, existe um período com
actividade enzimática máxima
Número de Ciclos
seguida de um período de actividade
reduzida, denominado fase plateau
 Growth Curve Variation

35,0 Run out

Run out Enzyme
30,0 Primer

Run out
25,0 Probes
Quantum
Yield
Norm Fluorescence

20,0 Competition Target

Concentration

15,0
Primer
Dimer
Probe
10,0 Concentration
Quenching
5,0 Efficiency
Target
Concentration
0,0
0 10 20
Ct30 40 50 60
Quantum
Yield
Cycles

Version 2.1
Roche Molecular Diagnostics
December 2007
Fases de Amplificação
• Uma análise detalhada do perfil
cinético permite dividi-lo em três fases:
• Fase inicial de background
• Fase média de crescimento
exponencial (ou fase linear logarítmica)
• Fase final de plateau
• A fase inicial está “escondida” na
fluorescência de ”background” e
representa a parte do PCR que não é
visível pelas tecnologias existentes.
• A cada ciclo de PCR, a fluorescência vai
aumentando, até que excede o limite de
detecção.
• O ciclo do PCR ao qual a intensidade
de fluorescência passa acima do valor
de “background” e se torna visível, é
denominado crossing point (Cp) ou
threshold cycle (CT)
• Neste ponto existem cerca de 1010 a
1012 moléculas amplificadas no tubo de
reacção.
 PCR & Signal Generation
Fluorescence Data

Cycle 1 Cycle 2 Cycle 3 Cycle 4 Ct

 Fluorescence data is collected at every cycle

 The Critical Threshold value (Ct) is defined as the fractional cycle number,
where sample fluorescence exceeds the Assigned Fluorescence Level
(AFL). It indicates the beginning of an exponential growth phase.
 Ct is often referred to as the “Elbow” or crossing point (Cp)
 PCR & Signal Generation
Concentration vs. Ct value

Titer Concentration:
1.0E+07 cp/mL
1.0E+06 cp/mL
1.0E+05 cp/mL
1.0E+04 cp/mL
1.0E+03 cp/mL
5.0E+02 cp/mL
negative

• Ct (elbow value) is related to input Concentration

• Typically, a 10-fold change in Concentration changes the Ct by 3.3 cycles
• A Higher input Concentration correlates with a lower Ct value
Concentrações e Crossing Points

Elevada concentração inicial

Fluorescência aumenta mais cedo

menor Cp
Intervalo linear do PCR em tempo-real
 PCR & Signal Generation
Co-Amplification of Target and QS

 Quantitation Standard is added to every reaction

 MasterMix reagent contains a second Probe, labeled with a different dye
 Internal Control (IC) -> Validation of results
 Quantitation Standard (QS) -> Titer calculation possible due to known QS copy number
-> Inhibition affects target and QS

Target Elongation: QS Elongation:

FAM HEX

Target Molecule QS Molecule

 TaqMan® PCR
Co-Amplification of Target and QS (1/2)

 Quantitation Standard is added to every reaction

 MasterMix reagent contains a second Probe, labeled with a different dye
 Internal Control (IC) -> Validation of results
 Quantitation Standard (QS) -> Titer calculation possible due to known QS copy number
-> Inhibition affects target and QS

Target Elongation: QS Elongation:

FAM HEX
Excitation: 494 nm Excitation: 535 nm
Emission: 519 nm Emission: 556 nm

Target Molecule QS Molecule

 TaqMan® PCR
Co-Amplification of Target and QS (2/2)

Target - FAM QS - HEX

 PCR em Tempo Real
Resumo dos Benefícios
• Resultados Rápidos
– Amplificação e Detecção simultâneas
• Maior Sensibilidade
• Diversidade de Aplicações
– Detecção de amplicon
– Quantificação
– Estudos de expressão genética (quantificação relativa)
– Análise de mutações, polimorfismos, etc.
• Intervalo Dinâmico Alargado
• Possibilidade de Automação
• Redução de fontes de contaminação
– O processo ocorre em tubo fechado – não há necessidade de manusear
produtos amplificados.