Fichas de ampliação

Fichas de ampliação de Biologia

Ficha de ampliação B1 – Técnica de PCR

Nome: N.° Turma:

Data: Professor:

Domínio: Crescimento, renovação e diferenciação celular

Capítulo: Expressão da informação genética
Aprendizagem Essencial por domínio: Explicar processos de replicação, transcrição e tradução
e realizar trabalhos práticos que envolvam leitura do código genético.

Documento I
A reação em cadeia da polimerase – PCR (Polymerase Chain Reaction) – é uma técnica muito
usada em biologia molecular, na análise forense, na biologia evolutiva e em diagnósticos médicos
que permite fazer múltiplas cópias de uma amostra de DNA com rapidez e precisão.
A técnica foi desenvolvida, em 1983, pelo bioquímico Kary Mullis, o que lhe valeu a atribuição do
Prémio Nobel de Química em 1993. Antes do desenvolvimento da PCR, os métodos usados para
amplificar ou gerar cópias de fragmentos de DNA eram demorados e trabalhosos. Com a técnica
PCR, os aparelhos onde são realizadas as reações (termociclador) podem produzir milhões de
cópias de um fragmento de DNA em apenas algumas horas.

A técnica de PCR é baseada nos processos naturais que uma célula usa para replicar uma nova
molécula de DNA. Os ingredientes biológicos necessários são os seguintes:
• DNA molde – ou seja, o DNA que contém a região a ser copiada (por exemplo, um gene);
• primers – sequências curtas de nucleótidos, complementares das sequências das extremida-
des do molde, que servem como ponto de partida para a cópia;
• nucleótidos livres – usados para construir as novas cadeias de DNA;
• DNA polimerase – enzima necessária que catalisa a ligação sequencial de nucleótidos livres
de acordo com as sequências do molde.

A PCR é um processo, com três etapas, que é realizado em ciclos repetidos.

O passo inicial é a desnaturação, ou separação, das duas cadeias da molécula de DNA. Isto é
conseguido aquecendo a amostra de DNA a temperaturas de cerca de 95 °C.
Na segunda etapa, chamada anelamento ou hibridização, a temperatura é reduzida para cerca
de 55 °C, para que os primers possam unir-se ao molde.
A terceira etapa – extensão ou polimerização – ocorre a uma temperatura de cerca de 72 °C.
Nesta fase, a DNA polimerase começa a adicionar nucleótidos às cadeias de DNA presentes a par-
tir das extremidades dos primers. No final do ciclo, que dura cerca de 5 minutos, a temperatura é
elevada e o processo recomeça.

O número de cópias dobra após cada ciclo. Normalmente, 25 a 30 ciclos produzem uma quan-
tidade suficiente de DNA (fig. 1). Um problema do procedimento de PCR original era que a DNA
polimerase tinha de ser reabastecida após cada ciclo, uma vez que não é estável nas altas tempe-
raturas necessárias para a desnaturação. Esse problema foi resolvido, em 1987, com a descoberta
de uma DNA polimerase termoestável, chamada Taq, uma enzima isolada da bactéria termofílica
Thermus aquaticus, que habita nas fontes termais.
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1.º CICLO 2.º CICLO 3.º CICLO CICLO n

1 2
Desnaturação Anelamento Extensão

Amostra 3' 5'

de DNA
Produtos
5' 3' PCR

3' 5' 2n cópias

Primers 5' 3'

Nucleótidos
livres

Taq polimerase

Figura 1. Técnica de PCR.

Documento II
O teste COVID-19 usa uma versão modificada da técnica de PCR, conhecida como qPCR. Este
método utiliza corantes fluorescentes para medir a quantidade de material genético do agente cau-
sador da infeção (SARS-CoV-2) nas amostras recolhidas através de cotonete nasal ou tubo de

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saliva. O vírus SARS-CoV-2, que causa a COVID-19, possui RNA como material genético. Por essa
razão, os eventuais fragmentos de RNA de cadeia simples existentes na amostra são convertidos
em cadeias de DNA num processo enzimático chamado transcrição reversa (fig. 2). A partir daqui,
o processo de amplificação do material genético, através da técnica de qPCR, pode ser realizado.
Os corantes fluorescentes ligam-se ao DNA à medida que a polimerização ocorre, permitindo iden-
tificar milhares de cópias de DNA correspondentes ao RNA viral SARS-CoV-2.
Colheita de amostra Transcrição reversa

Vírus SARS-CoV-2 RNA viral

Enzima
transcriptase
Corante reversa
fluorescente

RNA viral
Tubo de saliva Cotonete nasal DNA viral

Figura 2. Recolha de material biológico para determinação da carga viral.

1. Indique o tipo de ligações químicas que são quebradas durante a etapa de desnaturação.
2. Explique por que razão o número de cópias de DNA produzidas no termociclador dobra em
cada ciclo de reações.
3. Tendo em conta a ação dos primers e o facto de serem produzidos em laboratório, refira por
que razão é necessário conhecer a sequência de nucleótidos em cada extremidade do frag-
mento de DNA a ser replicado.
4. Tendo em conta que o SARS-CoV-2 é um retrovírus (um vírus com RNA), justifique a utilização
da expressão “DNA viral” no esquema da figura 2.