UENF LBT/CBB

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro Laboratório de Biotecnologia

Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

(PRÁTICA 3 – Biologia Molecular)

Coordenador: Prof. Gonçalo Apolinário de Souza Filho

Colaboradores: Luciano de Souza Vespoli
Patrícia Louzada Rangel
Suzane Ariádina de Souza
INTRODUÇÃO

A técnica, inicialmente, foi desenvolvida por Karry Mullis, que em 1993 foi ganhador
do Prêmio Nobel de Química. A Reação em Cadeia Polimerase é amplamente utilizada nos
laboratórios de biologia molecular, já que permite a amplificação de curtas seqüências de DNA
in vitro, em um milhão de cópias, em poucas horas, sem a necessidade de um sistema vivo de
células. A PCR envolve o uso de oligonucleotídeos sintéticos de DNA denominados iniciadores
ou primers que são complementares as sequências localizadas nas extremidades da região de
interesse.
A PCR compreende três etapas. Cada uma corresponde a um evento distinto,
com uma temperatura ótima de funcionamento.

1º Etapa: DESNATURAÇÃO
A primeira etapa corresponde a desnaturação da dupla fita de DNA, nesta a
temperatura é elevada entre 92 e 96 oC que leva à quebra das pontes de hidrogênio que
ligam as bases nitrogenadas.

2º Etapa: ANELAMENTO
A segunda etapa corresponde ao anelamento dos primers (oligonucleotídeos
sintéticos) de DNA, que se anelam à seqüências específicas localizados nas
extremidades do filamento molde. Nesta etapa, a temperatura é reduzida entre 42 e 60
o
C (dependendo do conteúdo C e G encontrada no primer) por alguns segundos. Os
primers são necessários para amplificação da cadeia porque fornecem o grupo 3’-OH
utilizado pela enzima polimerase, para dar início a amplificação da cadeia.

3º Etapa: EXTENSÃO
A terceira etapa corresponde à extensão, isto é, o início da polimerização da
cadeia. Nesta etapa, a polimerase dá início à síntese da cadeia adicionando, nas
extremidades dos primers anelados, os dNTPs (desoxirribonucleotídeos fosfatados) que
constituem os “blocos de construção” do filamento molde de DNA. Nesta etapa do ciclo
a temperatura é elevada a 72oC.

Todo o processo é repetido, a partir da desnaturação até a extensão, por várias

vezes (entre 25 e 40 vezes - denominados ciclos) até que se obtenha uma quantidade
razoável do DNA a ser amplificado.

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 ROTEIRO DE AULA PRÁTICA 3
Reação em Cadeia de Polimerase

OBJETIVO: A PCR permite a produção de grandes quantidades de um determinado

segmento de DNA in vitro a partir de uma pequena quantidade de DNA-molde. Nesta
aula, realizaremos a amplificação dos genes CYP71A12, FRK1, AT5G64890 e
WRKY30.

MATERIAL E MÉTODOS:

MATERIAL

• Água ultra pura

• Iniciadores
• DNA-molde (DNA genômico vegetal)
• Desoxirribonucleotídeos (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• Tampão da Taq DNA-polimerase
• Cofator enzimático (MgCl2)
• Taq DNA-polimerase

METODOLOGIA

1º Etapa: Em um microtubo para PCR, pipetar as seguintes soluções:

- Água ultra pura 14,8 µl
- DNA molde (50 ng/µl) 1,0 µl
- Iniciador 1 (20 pmol/µl) 0,5 µl
- Iniciador 2 (20 pmol/µl) 0,5 µl
- Tampão da Taq DNA-polimerase (10X)* 2,5 µl
- MgCl2 (25 mM) 1,5 µl
- dNTP's (1,25 mM) 4,0 µl
- Taq DNA-polimerase (5 U/µl)** 0,2 µl
__________

Volume total = 25,0 µl

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Nota: Uma unidade enzimática da DNA-polimerase é definida como a quantidade de
enzima necessária para catalizar a incorporação de 10 nmol de dNTP durante 30 min à
72 °C.

2º Etapa: Colocar a reação em um termociclador com a seguinte programação de ciclos

de temperatura:

95 °C - DESNATURAÇÃO INICIAL 5 minutos

95 °C - DESNATURAÇÃO 1 minuto
40 CICLOS 42 °C - ANELAMENTO 45 segundos
72 °C - EXTENSÃO 2 minutos
72 °C - EXTENSÃO FINAL 5 minutos
4 ° C - ARMAZENAMENTO a definir