Universidade Federal Fluminense

Faculdade de Medicina
Departamento de Patologia
Curso de Especialização em Análises Clínicas

Módulo: Biologia Molecular aplicado ao laboratório clínico

Datas das aulas: 29/04/2022 e 30/04/2022
Aluna: Raquel de Souza Sant'Anna de Oliveira

Avaliação referente ao módulo: Biologia Molecular aplicado ao laboratório clínico Data de

entrega da avalição: 14/05/2022

Questão 1. Descreva o princípio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) indicando quais as
etapas são realizadas nesta metodologia.
A técnica da PCR se baseia na amplificação de um trecho específico do material genético (DNA ou cDNA,
quando o alvo é em RNA) pela polimerização de centenas de milhares de cópias da sequência alvo a partir de
iniciadores específicos, que servirão como ponto de ancoragem para a polimerase, e utilizando-se substratos
que garantam as condições de trabalho da enzima (dNTPs, Mg+2, tampão). Utiliza-se a estratégia de ciclos de
tempos e temperaturas ideais para cada etapa. A etapa de desnaturação (+- 95°C) tem por objetivo a abertura
da fita de DNA, expondo os sítios de anelamento dos primers (iniciadores) específicos para a sequência alvo. A
partir da hibridização dos primers (52-65°C) a polimerase inicia a extensão da fita de DNA, a polimerase mais
utilizada atualmente é a TaqPolimerase, que tem temperatura ótima de ação em 72°C. Após o tempo necessário
para extensão da sequência desejada, nova etapa de desnaturação é realizada, liberando as sequências recém
sintetizadas e dando início a mais um ciclo.

Questão 2. Desenhe o par de primer (Forward e Reverso) que deverá ser utilizado para que a sequência
destacada em amarelo seja amplificada pela técnica de PCR.

5’ CCGCGCCCTC AAGGACGGTG TGGCAACGGG AGGCCATGCT (...) TACTACGCCG CTGGTCATGA AGAACCCGTG TTGGTGCAAA 3’

3’ GGCGCGGGAG TTCCTGCCAC ACCGTTGCCC TCCGGTACGA (...) ATGATGCGGC GACCAGTACT TCTTGGGCAC AACCACGTTT 5’

5’ CCGCGCCCTC AAGGACGGTG TGGCAACGGG AGGCCATGCT (...) TACTACGCCG CTGGTCATGA AGAACCCGTG TTGGTGCAAA 3’

<--- primer 3’ TCTTGGGCAC AACCACGTTT 5’
primer 5’ CCGCGCCCTC AAGGACGGTG 3’ --->
3’ GGCGCGGGAG TTCCTGCCAC ACCGTTGCCC TCCGGTACGA (...) ATGATGCGGC GACCAGTACT TCTTGGGCAC AACCACGTTT 5’

PR. REV. 3’ TCTTGGGCAC AACCACGTTT 5’ ---> NA POSIÇÃO DE LEITURA CORRETA ---> 5’ TTTGCACCAA CACGGGTTCT 3’
PR. FWRD. 5’ CCGCGCCCTC AAGGACGGTG 3’

Primer foward: 5’ – CCGCGCCCTCAAGGACGGTG – 3’

Primer reverso: 5’ – TTTGCACCAACACGGGTTCT – 3’

Questão 3. Sobre a Taq DNA polimerase utilizada na reação em cadeia da polimerase (PCR) assinale a
alternativa que indica uma das características dessa polimerase.
a) Realiza a polimerização de uma fita de RNA na direção 3’ – 5’;
b) É degradada em temperaturas acima de 70°C;
c) Realiza a polimerização da fita de DNA na direção 5’ – 3’;
d) Possui atividade exonuclease 3’ – 5.
Questão 4. Em relação a transcrição reversa assinale a alternativa que melhor define quando esta etapa é
necessária.
a) Para realizar a síntese de uma molécula de RNA a partir de uma molécula de DNA dupla fita;
b) Para realizar a síntese de DNA complementar (cDNA) a partir de uma molécula de RNA;
c) Para realizar a síntese de uma molécula de RNA dupla a partir de uma molécula de RNA fita simples;
d) Para realizar a síntese de DNA complementar (cDNA) a partir de uma molécula de DNA fita simples.

Questão 5. Em relação a metodologia Nested PCR assinale a alternativa correta.

a) Na Nested PCR são utilizados dois pares de primers em uma só etapa, com número de ciclos de
amplificação maior do que 60 ciclos;
b) Na Nested PCR são realizadas duas etapas de PCR e é utilizado o mesmo par de primers nas duas etapas;
c) Na Nested PCR é utilizado um par de primers em uma só etapa, com número de ciclos de amplificação
maior do que 60 ciclos;
d) Na Nested PCR são realizadas duas etapas de PCR sendo que na segunda etapa é utilizado um par de
primer diferente da primeira etapa.

Questão 6. Em um laboratório de biologia molecular foi realizada a técnica de PCR em tempo real utilizando
fluoróforo que tem como característica em se ligar em moléculas de DNA dupla fita (intercalantes de DNA
dupla fita). Qual alternativa abaixo indica o fluoróforo utilizado pelo laboratório.
a) Sybr Green
b) Sonda TaqMan
c) Ficoeritrina
d) Biotina

O gráfico abaixo se refere ao resultado de uma PCR em tempo real utilizando a sonda TaqMan. Considerando
o gráfico abaixo, respondam as questões 7 e 8.

Questão 7. No gráfico, as três setas representam amostras de pacientes diferentes. Assinale a alternativa que
melhor descreve os resultados obtidos.
a) A amostra 3 possui uma concentração de DNA alvo maior do que as amostras 1 e 2;
b) A amostra 1 possui uma concentração de DNA alvo maior do que a amostra 2;
c) A amostra 2 possui uma concentração de DNA alvo maior do que a amostra 1;
d) Todas as três amostras possuem a mesma concentração de DNA alvo.

Questão 8. Assinale a alternativa que melhor descreve a análise de resultado da PCR em tempo real utilizando
a sonda TaqMan
a) O valor de Ct (Cycle Threshold) é o ponto onde a curva de amplificação cruza o Threshold (linha
horizontal verde no gráfico);
b) O resultado das amostras amplificadas na PCR em tempo real utilizando a sonda TaqMan é confirmada
realizando uma corrida de eletroforese em gel de agarose;
c) O resultado das amostras amplificadas na PCR em tempo real utilizando a sonda TaqMan é confirmada
realizando uma análise da curva de dissociação;
d) Todas as alternativas estão corretas.

Questão 9. Em relação a PCR em tempo real utilizando o fluoróforo Sybr Green assinale a alternativa correta.
a) O fluoróforo Sybr Green tem como característica se ligar em moléculas de DNA dupla fita formadas durante
a amplificação;
b) Além da análise do Ct de amplificação da amostra deve-se analisar a curva de dissociação para avaliar se a
temperatura de dissociação encontrada corresponde a esperada;
c) A temperatura de dissociação indica que 50% da molécula está desnaturada e os outros 50% ainda em estão
em dupla fita.
d) Todas as alternativas estão corretas

Questão 10. Sobre a análise quantitativa utilizando a técnica de PCR em tempo real, assinale a alternativa
correta.
a) Na PCR em tempo real a detecção do valor do Ct de amplificação já indica a carga de DNA presente na
amostra analisada;
b) Para a análise quantitativa em uma PCR em tempo real utilizando a sonda TaMan é necessário ter
uma curva padrão preparada com amostra de concentração de DNA conhecida;
c) A PCR em tempo real é utilizada somente para para análise quantitativa;
d) Apenas a PCR em tempo real utilizando Sybr Green pode ser utilizada para análise quantitativa ou
semi-quantitativa.