Diagnóstico das Infecções Virais 1- Carga Viral: fase inicial, onde há a geração

de progênie viral. Após o processo infeccioso, há a

produção de partículas viáveis que têm genoma.
Tal carga viral será observada nas amostras
biológicas dependendo de cada vírus.

Na fase aguda da infecção (início dos sintomas),

tem-se a resposta do hospedeiro. A metodologia
que mais se destaca é a de detecção de carga
viral e, a principal técnica utilizada é a PCR.

Principais alvos do Diagnóstico Infeccioso 2- Fase crônica, onde os elementos do

hospedeiro (anticorpos) são os principais para o
 Métodos diretos = análise da presença do diagnóstico da infecção viral e, eles são detectados
vírus. pelos testes sorológicos.
 Métodos indiretos = análise de
FASE AGUDA
características do hospedeiro.
Foco: detecção direta do genoma e proteínas virais.
Amostras Biológicas para detectar vírus,
subprodutos e anticorpos

 Sangue ou soro (fração líquida após um

processo de coagulação);
 Secreção nasal e saliva (swab);
 Líquor = amostra mais difícil de ser obtida
(pela punção lombar do paciente);
 Tecidos (PCR), como a biópsia e a avaliação
de linfonodos (baço, pele, fígado, etc.).

Cada fase da infecção viral irá determinar o

método diagnóstico a ser usado.
Obs.: se houver a extração de um RNA viral, é
necessário preparar o DNA complementar (cDNA).
Isso é feito com solventes orgânicos, que são
colocados na amostra para se obter uma fase
aquosa onde haverá RNA e material de DNA.

Logo em seguida, há a preparação da reação PCR.

REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

Três etapas:
a) Desnaturação (94 - 96˚C) = abertura da
fita dupla de DNA.
b) Anelamento (55 - 60 ˚C) = iniciadores em
contato com o DNA (se anelam na fita em
sequências específicas onde apresentam
homologia) e incubação.
c) Elongação (72 ˚C) = taq polymerase se
liga a regiões onde há iniciador-fita. Assim, Detecção da carga viral para monitoração de
ocorre a síntese de uma nova fita de DNA. sucesso terapêutico.

A amplificação é apenas da sequência do genoma Exemplo:

viral.

Reagentes utilizados para a PCR

 Amostra biológica de DNA;

 Iniciadores: sequências pequenas de
nucleotídeos que vão se alinhar em regiões
específicas do DNA da amostra biológica, caso ela
seja positiva.
 Nucleotídeos: para propagar e amplificar a
amostra inicial obtida.
 Enzima: taq polymerase, capaz de
amplificar a fita de DNA; Tipos de PCR:
 Tampão com sais importantes para a
reação. Ensaio Multiplex = com múltiplos alvos. Uso de
 Tubo para a reação. iniciadores distintos numa reação e amplificar o
gene. Podem-se utilizar sondas coloridas para
detectar quais são as fitas que se amplificaram em
detrimento dos primers aplicados.

Teste NAT (Nucleic Acid Test) = kit que se baseia

em PCR em tempo real (multiplex) e possui alta
sensibilidade para detecção de presença do
genoma viral do HIV, HCV e HBV circulantes no
plasma sanguíneo.

O diagnóstico de infecções virais não se restringe

apenas a detecção de elementos na fase aguda.
PCR TEM APLICABILIDADE NA FASE
CRÔNICA? FASE CRÔNICA

Sim. A carga viral pode ser detectada anos após a
infecção viral, na fase crônica tardia (persistente).
Há outros casos, como a infecção latente
(latência), em que o vírus gera uma viremia inicial
na fase aguda e para de gerar a progênie viral,
integra o seu genoma à célula hospedeira e
aguarda o momento certo para reativação.
Testes sorológicos e detecção de imunoglobulinas
IgM (fase aguda), IgA (fase aguda) e IgG (fase
crônica).
Imunoensaios = detecção indireta de anticorpos
(antivírus). Podem ser utilizados, também, para
detectar proteínas virais (antígenos).

Geralmente, têm-se anticorpos reagentes
(acoplados a enzimas que vão degradar substratos
adicionados na amostra) que são produzidos para
detecção de antígenos virais específicos e
anticorpos derivados da amostra, ou anticorpos
reagentes para ENSAIO SANDUICHE.
IgM -> se liga em mais de um alvo.
IgA -> abundante em secreções.
IgG -> monoclonais, específicas e de alta avidez ao
antígeno.
Os anticorpos devem se ligar e neutralizar os vírus
circulantes e reconhecer células infectadas, além
de sinalizar o processo infeccioso a outras células.
O teste das imunoglobulinas é feito através da
curva de titulação de anticorpos.
Indica que, quanto mais anticorpos houver, maior
a ligação-antígeno e melhor a observação e
quantificação do precipitado.
PRÓ-ZONA (excesso de anticorpos) = Muito
anticorpo e quantidade fixa de antígeno não há
reatividade leitura baixa.
ZONA DE EQUIVALÊNCIA = quantidade
equivalente de anticorpos (Ac) e antígenos (Ag),
onde há a ligação máxima entre eles.
PÓS-ZONA (excesso de antígenos) = decaimento
crescente da reatividade e da precipitação de
imunocomplexos de antígenos com anticorpos.
Diluição sucessiva do soro diminui a quantidade
de anticorpos. Redução da ligação anticorpo-
antígeno.
Ensaios Sorológicos
1) Não marcados: aglutinação e
hemaglutinação. Só funcionam para a formação de
complexos Ac-Ag grandes. Menor sensibilidade
(caíram em desuso).
2) Marcados: radioativos, enzimáticos,
fluorescentes, quimioluminescentes. Maior
sensibilidade (sinal amplificado).
Aglutinação indireta – Cobertura de antígenos
virais nas esferas de látex, colocadas na presença
da amostra biológica proveniente do soro, cujos
anticorpos se ligam a elas, vão precipitar e formar
amalgamados visíveis a olho nu, permitindo a
identificação desses anticorpos.
A formação de imunocomplexos é diretamente
proporcional à presença de anticorpos anti-
antígenos virais, indicando um resultado positivo
ou negativo. Ex.: MonoSpot e Mono-Látex.
Ensaios Imunoenzimáticos
Teste colorimétrico = Sistema específico de
formação de cor. Feito em microplacas para
avaliação de várias amostras em um único ensaio.
Mais rápido e dinâmico. Técnica para a detecção e
quantificação de antígenos ou anticorpos em Fracionamento de antígenos de interesse com
suporte sólido. posterior incubação com anticorpos primários e
secundários conjugados com enzimas.
Ensaio direto: detecção de antígeno viral com
anticorpo específico conjugado à enzima, com
posterior incubação com substrato cromogênico
(convertido em cor).

Imunocromatografia

Testes rápidos

Baseados em imunocromatografia utilizando

Ensaio indireto: detecção do anticorpo do
paciente. Coloca-se o antígeno do vírus e o soro do
paciente numa placa, além de um anticorpo
secundário conjugado com uma enzima que
receberá o substrato, o qual muda de cor.
antígenos fixados em suporte sólido (membranas
de celulose ou nylon, látex ou cartelas plásticas).
Apresentam sensibilidade e especificidade
similares ao ELISA de terceira geração porém, em
populações com baixa prevalência, aumentam os
falso-positivos.

Ensaio sanduíche: anticorpo de captura se liga ao

antígeno. Em seguida, há um anticorpo secundário
conjugado a uma enzima também.

Quimioluminescência (CLIA)

O modo mais sensível de detecção em

imnoensaios. Produção de luz por uma reação
química de oxirredução.

Western-Blot

Ensaio imunoenzimático com a utilização de um

anticorpo secundário conjugado com enzima.
Detecção de reatividade para proteínas específicas
virais.
Conclusão

No diagnóstico, portanto, deve-se levar em conta a

etapa e o tipo de infecção (recente – aguda; tardia
– crônica ou latente). Além disso, levar em conta a
forma de liberação do vírus para definir a amostra
biológica (swab nasal, sangue, líquor, etc.).