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Dicas Técnicasllllllllmm

A aplicação de nested PCR em diagnósticos

Tubo único médicos implica que o mesmo tipo de reação
Marcador de peso molecular de DNA

PCR aninhado seja realizada repetidamente no mesmo O marcador foi uma digestão HpaII de pUCBM21,
contendo fragmentos de 1114, 900, 692, 501/489,
com laboratório por longos períodos de tempo, como
no monitoramento longitudinal de pacientes
404, 320, 242, 190, 147, 124, 110, 62, 37, 34,
26 e 19 bp (Padrão VIII , Boehringer Mannheim,
reagentes imunossuprimidos para infecções virais, (1) ou
no monitor doação de sangue para agentes
Alemanha).

estáveis à temperatura ambiente

infecciosos transmissíveis. (~-s) Para garantir a
Carsten Wolff, Dirk
Hornschemeyer, Dietmar
Wolff e Knut Kleesiek
Instituto de Laboratório e
medicina transfusional, cardíaca e
Centro de Diabetes Renânia do Norte-Vestfália,
Clínica Universitária da Universidade do Ruhr
Bochum, Bad Oeynhausen, Alemanha
conformidade, é desejável usar misturas de
reagentes de PCR pré-formuladas que podem
ser preparadas com antecedência em lotes e
podem ser mantidas em estoque, em vez de
preparar uma nova mistura de reagentes para
cada PCR
ensaio.
Reações falso-positivas na PCR podem surgir
da autocontaminação com DNA amplificado
("carryover"). Esse problema é agravado na PCR
aninhada, porque o DNA amplificado (produto
de PCR de primeira rodada) precisa ser
transferido manualmente para os tubos para a
PCR de segunda rodada. Para evitar esse risco
adicional de transferência, é desejável realizar
PCR de primeira e segunda rodada em um tubo
de reação sem abri-lo durante todo o processo .
(6)
Modificamos o PCR aninhado para que seja
realizada em um único tubo, usando misturas de
reação de PCR pré-formuladas incorporadas em
uma matriz de trealose. (7-1°) Estas misturas pré-
formuladas podem ser armazenadas por I>6 meses
à temperatura ambiente. Comparamos o
desempenho dessa PCR aninhada de tubo único
com a PCR aninhada convencional. Amostras de
sangue de diferentes pacientes com infecções
virais foram analisadas, incluindo infecções com o
vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV 1),
vírus da hepatite C (HCV) e citomegalovírus (CMV).
MATERIAIS E MÉTODOS
termociclador, tubos de PCR e
Enzimas
O termociclador foi um Varius V 80 (cinco blocos,
cada um contendo 16 tubos de PCR de 0,2 ml)
(Landgraf, Hannover, Alemanha), com taxas de
aquecimento/resfriamento de 2,5°C/seg.
Os tubos de PCR eram de 0,2 ml (Perkin
Elmer, Vaterstetten, Alemanha).
Enzimas: DNA polimerases GoldStar
(Eurogentech, Seraing, Bélgica), Ampli Taq
(Perkin-Elmer, Vaterstetten, Alemanha) e
transcriptase reversa do vírus da leucemia
murina de Moloney (Mo-MLV RT, Pharmacia,
Freiburg, Alemanha).
DNA de controle para determinação de
Limite de Detecção Inferior
Para o CMV, foi utilizado o clone plasmídico
pRR47 contendo um fragmento de DNA viral de
6,7 kb da região do gene inicial imediato principal
do CMV. (z6) Para HCV e HIV 1, os produtos de
PCR da primeira rodada foram purificados por
eletroforese preparativa em gel de agarose.
DNA e RNA de controle positivo
Extratos de ácido nucléico de sangue periférico
de pacientes com AIDS (HIV 1 proviral DNA),
receptores de transplante cardíaco com reativação
de CMV (CMV DNA) e pacientes com hepatite
C (HCV RNA) foram obtidos de amostras de
diagnóstico de rotina.
Outros reagentes
Trifosfatos desoxinucleosídeos (Phar macia,
Freiburg, Alemanha), sais e tampões (Merck,
Darmstadt, Alemanha) e óleo mineral (Perkin-
Elmer, Vaterstet ten, Alemanha) foram usados.
Amostras de sangue
Para detecção de HIV 1 e CMV, sangue venoso
anticoagulado (1,6 mg K-EDTA/ml) foi coletado
com sistemas padrão de 2,7 ml para fins
hematológicos (Sarstedt, Niimbrecht, Alemanha).
Trinta e oito amostras de pacientes anti-HIV
positivos foram testadas com PCR específico
de DNA de HIV 1, e 56 amostras de receptores
de transplante de coração imunossuprimidos
sob terapia contínua com ciclosporina A foram
usadas para PCR específico de CMV.
Cento e vinte amostras de soro de pacientes
positivos para anti-HCV com patopatias foram
testadas com RT-PCR específico para HCV.
Extração de Ácido Nucleico
Os ácidos nucleicos foram extraídos com
Colunas giratórias QIAamp (Diagen GmbH,
Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções
do fabricante: Duzentos

376 Métodos de PCR e Aplicações 4:376-379 © 1995 por Cold Spring Harbor Laboratory Press ISSN 1054-9803/95 $ 5,00
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mWllllllll dicas técnicas

TABELA 1 Primers de oligonucleotídeos em misturas de PCR pré-formuladas ção de tampão PCR 10x. O tampão de PCR
(1 x) para a polimerase GoldStar foi Tris-C1 75 mM (pH
Vírus Primeiro Sequência (5' --> 3') Literatura
9,0), (NH4)zSO4 20 mM, MgCl2 1,5 mM e Tween 20
Produto de PCR de primeira rodada 434 pb, produto de PCR aninhado 338 pb 0,01%; o tampão de PCR (lx) para AmpliTaq Poly
merase foi 20 mM Tris-C1 (pH 8,3), 50 mM KC1, 1,5
HIV externo 5' AA TGT CAG CAC AGT ACA ATG TAC 13
externo CA GTA GAA AAA TTC CCC TCC ACA ATT mM MgC12 e 0,01% de gelatina. Após a adição do DNA

3' aninhado CT GCT GTT AAA TGG CAG TCT AGC modelo no tubo de PCR, os reagentes incorporados na
5' aninhado 3' T TTC TGG GTC CCC TCC TGA GGA matriz de trealose foram dissolvidos

Produto de PCR de primeira rodada 340 pb, produto de PCR aninhado 286 pb
HCV NCR 1 (externo 5') GG CGA CAC TCC ACC ATA GAT 14
GT GCA CGG TCT ACG AGA CCT sem agitação. A camada aquosa foi recoberta com 40
NCR 2 (externo 3')
C CAC CAT AGA TCT CTC CCC TGT p,1 de parafina líquida.
NCR 3 (aninhado 5')
NCR 4 (aninhado 3') CA CTC TCG AGC ACC CTA TCA GGC AGT As condições do ciclo estão listadas na Tabela 3. Após
a primeira rodada de PCR, o tubo fechado foi invertido
Produto de PCR de primeira rodada 434 pb, produto de PCR aninhado 110 pb para dissolver a segunda rodada
CMV MIEA 4 (exterior 5') C CAA GCG GCC TCT GAT AAC CAA GCC 15,16
C AGC ACC ATC CTC CTC TTC CTC TGG reagentes dentro da tampa, brevemente centrifugados
MIEA 5 (exterior 3')
e devolvidos ao termociclador para PCR de segunda
MIEA 6 (aninhado 5') A GTG TGG ATG ACC TAC GGG CCA TCG
MIEA 7 (aninhado 3') G GTG ACA CCA GAG AAT CAG AGG AGC rodada. Traços de xileno cianol ou bromofenol na
segunda mistura de reagentes ajudaram a visualizar
sua dissolução completa.

A concentração ideal de primers de primeira rodada

microlitros de solução salina de guanidínio e 25 ~1 de
solução estoque de proteinase K (ambos fornecidos
pelo fabricante) foram misturados com 200 ~l de
sangue total anticoagulado e incubados a 70°C
por 10 min. Isopropanol (210 pd) foi adicionado e a
mistura foi brevemente agitada em vórtex, aplicada a
uma coluna de spin QIAamp e centrifugada a 6000g
por 1 min.
Duas vezes, 500 p.1 de tampão de lavagem foram
adicionados e centrifugados a 6000g por 1 min. Os
ácidos nucleicos foram eluídos com 100 ~l de água
quente (70°C, 1 min de centrifugação a 6000g). Para o
RNA, foi utilizada água tratada com pirocarbonato de
dietila. O eluído de ácido nucleico (5 ~l) foi usado para
PCR ou transcrição reversa e levado a 20 pd com água
e tampão apropriado.
Preparação de tubos de PCR
Mistura de PCR pré-formulada para o primeiro
rodada foi pipetada no fundo do tubo e a segunda
rodada de mistura de PCR pré-formulada no interior
da tampa.
Os tubos abertos foram então mantidos em um
incubador a 35-40°C por 2-3 horas até que o
os reagentes secaram. Depois de secos, os tubos
podem ser armazenados à temperatura ambiente em
local seco (exsecador ou saco plástico selado) por
vários meses.
PCR
A solução aquosa de DNA molde (cDNA no caso de
PCR específico para HCV) foi ajustada às concentrações
de sal e tampão recomendadas pelos fabricantes das
DNA polimerases por adição
foi determinada experimentalmente. Esses primers
tiveram que ser empregados em concentrações
reduzidas (Tabela 2) para garantir seu consumo
completo durante a PCR de primeira rodada e para
suprimir a formação de produtos de PCR indesejados
decorrentes de combinações de primers de primeira e
segunda rodada.
PCR Aninhado Convencional
A PCR aninhada convencional foi realizada em reações
de primeira rodada 20-p,1.
As misturas de reação tiveram o mesmo com
posição conforme descrito para PCR aninhada de tubo
único, com exceção de que não havia trealose e os
primers da primeira rodada eram 1 p,M em todas as
reações. O produto da primeira rodada (2 pA) foi
transferido para

Transcrição reversa do RNA do HCV

Cinco microlitros de extrato de RNA foram re

verso transcrito com Mo-MLV RT em uma reação 20
TABELA 2 Componentes da mistura de PCR e reagente pré-formulado para reações 20-p.1
p.1, (12) de acordo com as instruções do fabricante. Concentração na
cinco microlitros Componente Quantidade mistura pré-formulada a Concentração na PCR
da solução de cDNA foi usado para PCR.
Primários externos
(HCV) 0,8 pmoles 0,24 ~M 0,04 FLM
(CMV) 2,0 pmoles 0,61 FLM 0,1 pLM
PCR aninhado de tubo único
(HIV) 2,9 pmoles 0,88 p,M 0,14 p,M
A mistura de PCR pré-formulada (sem tampão) continha Primers aninhados 20 pmoles 6 R,M 1 R,M
(todos) dATP, dCTP, dGTP, dTTP 5 nmoles 1,5 mM 250 p,M
trealose, os quatro dNTPs, DNA polimerase (GoldStar
DNA polimerase (estrela dourada) 0,35 0,11 U/R,1 0,0175 U/R,1
ou Am pliTaq) e primers. Os componentes estão Trealose unidades 0,44 mg 13,3% (peso/vol) 2,2% (peso/vol)
listados nas Tabelas 1 e 2. Para uma reação 20-~1, 3,3
~l da primeira mistura pré-formulada e 3,3 ~l da segunda MgCl2 EM 2,5 mM
(NH4)2S04 EM 20 mM
rodada
Tris-cloreto (pH 9,0) EM 75 mM
entre 20 EM 0,01%
mistura foram necessárias (uma reação de 50-~1
requer 8,3 pd de cada mistura). a(NI) Não incluído.

Métodos e Aplicações de PCR :]77

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Dicas Técnicasllll|E

TABELA 3 Parâmetros de PCR primer redondo/primeiro de segundo turno) foi reduzido

gradualmente até que os produtos de PCR derivassem de
Ciclos Perfil do ciclo combinações de primeiro e
Vírus (n.º por volta) (primeira e segunda voltas)
primers de segunda rodada desapareceram no gel de agarose
HIV1 primeiro: 40 30 seg a 94°C, 45 seg a 55°C, 50 seg a 72°C (Fig. 1). As proporções ótimas de primer variaram entre 1:7
segundo: 40 (primeira descoberta/segunda rodada) para a amplificação do
AVC primeiro: 28 30 seg a 94°C, 40 seg a 50°C, 30 seg a 72°C DNA do provírus HIV 1, 1:10 para DNA de CMV e 1:25 para
segundo: 28
cDNA de HCV (Tabela 1).
CMV primeiro: 30 25 seg a 94°C, 35 seg a 57°C, 35 seg a 72°C
segundo: 30

O mesmo número de ciclos e o mesmo perfil de temperatura foram usados tanto para PCR nested de tubo único quanto para PCR
nested convencional.
Sensibilidade de tubo único aninhado
PCR

Diluições seriadas de DNA de controle (produtos de PCR de

18 ~ 0,1 da mistura de PCR de segunda rodada. O
as composições das misturas de PCR são dadas em (Tabela 2).
Análise de DNA amplificado
primeira rodada purificados obtidos de cDNA de HCV e DNA
sensibilidade; no entanto, esse método ainda não está
proviral de HIV 1 e DNA de plasmídeo pRR47 linearizado com
padronizado. Existem muitas modificações de protocolos padrão
EcoRI contendo DNA de CMV) foram amplificados a partir de
e a consistência entre ensaios ainda não é aceitável. (17)
concentrações na faixa de 0,1 a 100 cópias. Os limites de
detecção foram entre 1 e 10 cópias (Tabela 4). PCR aninhado
A PCR quantitativa, em particular, requer reagentes uniformes
de tubo único detectou nucléico viral
e estáveis. Para atingir os padrões de química clínica para PCR

Os produtos de PCR foram separados em géis de aga rose a (condições de reação definidas com precisão, reprodutibilidade

3% e visualizados por coloração com brometo de etídio. Os
comprimentos das cadeias foram determinados por
coeletroforese de um marcador de peso molecular de DNA.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
do método em diferentes laboratórios e dentro de um laboratório
ao longo do tempo) é desejável usar reagentes pré-formulados
estáveis. Comparamos a detecção de DNA proviral de HIV 1,
DNA de CMV e cDNA de HCV por PCR nested de tubo único e
por PCR nested convencional.
ácido em todas as amostras que foram positivas na nested PCR
convencional e em algumas amostras que foram negativas na
nested PCR convencional. (Tabela 5).
Em conclusão, a PCR aninhada em um único tubo com
misturas de reação pré-formuladas e estáveis à temperatura
ambiente oferece várias vantagens sobre o procedimento

A PCR tornou-se uma importante ferramenta de diagnóstico
médico devido ao seu alto
Concentrações de primer
A proporção ideal de concentrações de primers da primeira
para a segunda rodada em uma única PCR aninhada em tubo
depende do tipo de DNA modelo. Esta proporção foi determinada
experimentalmente. Usando um DNA de controle positivo , a
proporção de primers (primeiro
convencional: (1) os reagentes podem ser preparados com
antecedência em grandes lotes, proporcionando desempenho
reprodutível e, portanto, em terassay (e interlaboratorial)
conformidade; (2) após a amplificação inicial, não há
transferência tubo a tubo. Uma fonte principal de
autocontaminação com DNA amplificado é eliminada, e (3)
padrões de ácido nucléico podem ser adicionados ao re
agentes para permitir PCR quantitativo.

TABELA 4 Limites inferiores de detecção de tubo único específico para CMV, HCV e HIV 1
PCR aninhado
1 2 3 4

Número de cópias do Reações positivas em

FIGURA 1 Eletroforese em gel de agarose de produtos de PCR
DNA de controle DNA modelo 10 ensaios de PCR (n.º)
de PCR aninhada de tubo único. Esquerda e direita: marcador de
comprimento da cadeia de DNA. Os comprimentos dos CMV 100 10
fragmentos são 1194, 900, 692, banda dupla 501/489, 404, 320, 10 8
(plasmídeo pRR47)
242, 147, 124 e 110 pb (pouco visível). (Pista 1) PCR aninhado
convencional específico para HCV, produto de primeira rodada 1 0,1 ~ 10
a 340 pb (6 ~1 aplicado). (faixa 2) PCR aninhado de tubo único
AVC 100 10
específico de HCV. Somente o produto da segunda rodada é
(produto de PCR de primeira rodada purificado) 10 10
visível a 286 pb; nenhum produto da primeira rodada é visível a
340 pb (6 wl aplicados). (pista 3) PCR aninhado convencional
1 0,1 ~ 40
específico de HIV 1. Produto de primeira rodada reamplificado,
a 434 pb. (Pista 4) PCR aninhado de tubo único específico para HIV 1 I00 eu0
HIV 1. Somente o produto da segunda rodada é visível a 338 pb; I0 I0
(produto de PCR de primeira rodada purificado)
nenhum produto da primeira rodada é visível a 434 pb (6 wl
aplicado). Dímero de primer na frente. 1 0.I" 60

aNominalmente 0,1.

378 Métodos e Aplicações de PCR

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TABELA 5 Comparação de tubo único
Técnica de PCR aninhada e
PCR Aninhado Convencional
Convencional de tubo único
PCR PCR
Amostras de Vírus (positivo) (positivo)
HIV tem 38 34 34
VHC b 120 59 55
CMV c 56 23 21
aPacientes anti-HIV positivos. Os ácidos nucleicos
foram extraídos do sangue total anticoagulado (sangue
EDTA). bPacientes anti-
HCV positivos com hepatopatias. Os ácidos nucleicos
foram extraídos de se
rum.
Pacientes transplantados cardíacos com
imunossupressão. Os ácidos nucleicos foram extraídos
de um sangue total coagulado (sangue EDTA).
REFERÊNCIAS
1. Meyer-König, U., A. Serr, D. von Laer, G.
Kirste, C. Wolff, O. Haller, D. Neumann Haefelin
e FT Hufert. 1995. Transcrições imediatas precoces
e tardias do citomegalovírus humano em leucócitos
do sangue periférico - valor diagnóstico em
receptores de transplante renal. J. Infectar. Dis.
171: 607-613.
2. Zhang, HY, K. Kuramoto, D. Mamish, K.
Sazama, PV Holland e JB Zeldis.
1993. Vírus da hepatite C em amostras de sangue
de doadores voluntários. ]. Clin. Microbiol. 31:
606-609.
3. Brechot, C. 1993. Reação em cadeia da polimerase
para o diagnóstico de hepatite viral B e C. Gut
(Suppl.) 34: 39-44.
4. Bárbara, JAJ e JA Garson. 1993. Reação em
cadeia da polimerase e microbiologia de transfusão.
Vox cantou. 64: 73-81.
5. Wolff, C., D. Hörnschemeyer e K.
Kleesiek. 1994. Hepatite C viremia em doadores
de sangue alemães: A alanina transferase sérica
não é um marcador válido para triagem.
Transfusion 34: 361-362.
6. Allan, B., H. Smuts e LM Steyn. 1993.
Tubos de reação modificados para adição
sequencial de reagentes em ensaios de PCR. Res.
de Ácidos Nucleicos. 22: 109-110.
7. Colaco, C., S. Sen, M. Thangavelu, S. Pinder e B.
Roser. 1992. Estabilidade extraordinária de
enzimas secas em trealose: Sim plified Molecular
Biology. BioTechnology 10: 1007-1011.
8. Ramanujam, R., J. Koelbl, E. Ting, j. Jolly e B.
Burdick. 1993. Reagentes de PCR estáveis à
temperatura ambiente. Métodos de PCR Aplicáveis.
3: 75-76.
9. Ramanujam, R., J. Heaster, C. Huang, J. Jolly, J.
Koelbl, C. Lively, E. Ogutu, E. Ting, S. Treml, S.
Aldous, R. Harley, S. Mathias, F. Franks e B.
Burdick. 1993. Am bient-temperature-stable
molecular biol
EIIIIII dicas técnicas
reagentes ogy. BioTechniques 14: 470-474.
10. Kaijalainen, S., PJ Karhunen, K. Lalu e K. LindstrOm.
1993. Uma técnica alternativa de início a quente
para PCR em pequenos volumes usando grânulos
de componentes de reação embutidos em cera
secos em trealose. Res. de Ácidos Nucleicos. 21:
2959-2960.
11. Stamminger, T., E. Puchtler e B. Fleckenstein.
1991. A expressão discordante das regiões
imediatas precoces dos genes I e 2 do
citomegalovírus humano nos primeiros tempos
após a infecção envolve eventos de processamento
pós-transcricionais. j. Virol.
65: 2273-2282.
12. Wolff, C., K. Schlfiter, W. Prohaska e K. Kleesiek.
1992. Detecção melhorada do RNA do vírus da
hepatite C por transcrição reversa e reação em
cadeia da polimerase. EUR.
J. Clin. Chem. Clin. Bioquim. 30: 717-727.
13. Oram, JD, RG Downing, M. Roff, N.
Serwankambo, JCS Clegg, ASR Featherstone e
JC Booth. 1991. Análise de sequência das regiões
de loop V3 dos genes env dos provírus de
imunodeficiência humana de Uganda. AIDS Res.
Zumbir. Retrovir. 7: 605-614.
14. Garson, JA, C. Ring, P. Tuke e RS
Tedder. 1990. Detecção aprimorada por PCR do
RNA do vírus da hepatite C. Lancet 333: 878-879.
15. Demmler, GJ, GJ Buffone, CM Schimbor e RA
May. 1988. Detecção de citomegalovírus na urina
de recém-nascidos usando amplificação de DNA
por reação em cadeia da polimerase. J. Infectar.
Dis. 158: 1177-1184 .
16. Fenner, TE, J. Garweg, FT Hufert, M.
Boehnke e H. Schmitz. 1991. Diagnóstico de
retinite induzida por citomegalovírus humano em
indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência
humana tipo 1 usando a reação em cadeia da
polimerase. J. Clin. Microbiol. 29: 2621-2622.
17. Zaaijer, HLHTM Cuypers, HW Ree sink, IN Winkel,
G. Gerken e PN
Lelie. 1993. Confiabilidade da reação em cadeia
da polimerase para detecção do vírus da hepatite
C. Lancet 341: 722-724.
Recebido em 13 de setembro de 1994; aceito na forma
revisada em 27 de fevereiro de 1995.
Métodos de PCR e Aplicações J79
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PCR aninhado de tubo único com reagentes estáveis à temperatura ambiente.

C Wolff, D Hörnschemeyer, D Wolff, et al.

Genoma Res. 1995 4: 376-379

Referências Este artigo cita 17 artigos, 3 dos quais podem ser acessados gratuitamente
em: http://genome.cshlp.org/content/4/6/376.full.html#ref-list-1

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