Bebês internados em unidades de terapia intensiva neonatal por suspeita

de sepse bacteriana recebem pelo menos dois antibióticos de amplo

espectro para um mínimo de 48 a 72 horas para cobrir ambos
os organismos gram-positivas e gram-negativas, enquanto se aguarda os
resultados da cultura de sangue. Em média, o crescimento bacteriano torna-se
detectável dentro de 12 a 24 horas, com um adicional de 24 a 48 horas exigido
para identificação. Temos descrito anteriormente usando um ensaio
de PCR 16S rRNA para triagem neonatal de
sangue para DNA bacteriano. Combinando com PCR de seqüenciamento de
DNA poderia provar um meio mais rápido de detecção de bactérias do que a
identificação da cultura-based. Se a terapia, bem-sucedida de
antibióticospoderia ser adequadamente adaptadas, mais cedo, poupando
assim as crianças a administração de antibióticos desnecessários. Nosso
objetivo foi avaliar o potencial de pyrosequencing para diferenciar entre as
bactérias comumente associados com sepse neonatal. Para começar, o
seqüenciamento full-length do 380-bp amplicons 16S rRNA de
bactérias representante foi conduzido (ABI 3100) e vários bancos de
dados consultados. Estes incluíam Staphylococcussp. ,
Streptococcus sp. , Listeria sp. E numerosos bastonetes gram-negativos. As
seqüências de isolados clínicos eram idênticos aos presentes nas bases de
dados publicados pelamesma bactéria. Como resultado, um informativo 15
basesdentro do amplicon de 380 bp foi alvo de pyrosequencing culturade
enriquecimento seguinte e amplificação pela PCR. Um totalde 643 isolados
bacterianos comumente associados com sepseneonatal, e 15 PCR-
positivo, cultura positiva neonatal amostras de sangue total foram analisados
por pyrosequencing.Resultados de sequenciamento de DNA e identificação da
cultura foram comparados. Em resumo, fomos
sucesso no uso de PCR e pyrosequencing juntos paradiferenciar com
precisão muito diversos grupos de bactérias.
Diagnóstico de sepse neonatal é difícil, pois os sinais e sintomas em crianças
são sutis e, muitas vezes imitam outras condições médicas, como a hipotermia,
a transição retardada, ou transitórios tachypnea.1-4 Se o recém-nascido é
infectado, então antibioticoterapia não se justifica, como sepse é umamédica
lifethreatening emergency.3-5
Hoje em dia, a maioria das técnicas de cultura de sangue usar instrumentação
automatizada, seguida pela identificação fenotípica dos purificados isolate.6
Em geral, esta abordagem requer 2 a 3 dias para ser concluído. Apesar de
cultura de sangue automatizado é considerado o padrão-ouro, mesmo essa
abordagem pode sofrer de baixa sensibilidade, devido à semeadura
intermitente de baixo número de bactérias dentro do fluxo de sangue, coleta de
sangue volumes pequenos, ou a prática cada vez mais comum de fornecer
intra-parto antibióticos para mães de alto risco deliveries.7-9
Como resultado, muitas crianças recebem antibióticos, embora algumas
infecções bacterianas são documented.2, 10,11 De fato, entre 5% e 10% de
todas as crianças em os EUA receber antibioticoterapia sistêmica annually.12
Geralmente durante a avaliação inicial da sepse, quando o agente etiológico é
desconhecido, a criança receberá dois antibióticos de largo espectro. Essa
prática oferece cobertura para ambos os organismos gram-positivas e gram-
negativas. Infelizmente, esta prática pode levar à destruição do bebê é
normais flora gastrointestinal eo risco de se tornar colonizados com drug-
resistant microorganisms.13 Projetando uma abordagem que pode mais
rapidamente diferenciar entre os patógenos transmitidos pelo sangue
comumente associados com sepse neonatal pode resultar em recém-nascidos
recebendo ou menos doses de antibióticos desnecessários ou um mais
adaptado regime de antibióticos mais cedo. Técnicas moleculares como a PCR
tem sido usado com sucesso para diagnosticar uma grande variedade de
agentes infecciosos, incluindo bactérias, fungos, vírus e protozoa.14, 15 de
Melhoria sobre esta abordagem, além de gerar um resultado positivo ou
negativo, para incluir informações de seqüência de diferenciar entre grupos de
bactérias pode se mostrar valiosa.
Visando uma seqüência do gene 16S rRNA para este fim tem muitas
vantagens, ela está presente como várias cópias por célula, e contém
tanto altamente conservadas e variáveis Pyrosequencing regions.16-18
(Biotage, Uppsala, Suécia), uma tecnologia relativamente nova,
proporciona rápida , curto lerseqüenciamento de 30 bases em cerca de
30 minutos. Outros investigadores têm utilizado esta abordagem para
classificar, identificar e subtipo de uma variedade de rDNA 16S de
bactérias fragments.19-21 O objetivo aqui foi avaliar o uso potencial
de pyrosequencing de distinguir entre os diferentes isolados de
bactérias comumente associados com sepseneonatal em relação ao
convencional identificação fenotípica.Nossos resultados indicaram que uma
seqüência de bases 15gerados por pyrosequencing após análise
de PCR 16S rRNAconsistentemente diferenciada entre os diversos grupos de
bactérias comumente associados com sepse neonatal. A
identidade por pyrosequencing comparado favoravelmente aos
determinados por métodos convencionais de identificação fenotípica. Se
implementada,
combinando 16S rRNA triagemcom PCR pyrosequencing poderia resultar
em regime antibiótico a criança está sendo adaptado mais cedo e, assim,ajudar
a reduzir os riscos de alterar o recém-nascido é normalflora intestinal eo
aparecimento de resistência bacterianaemergentes devido ao uso de
antibióticos desnecessários.

Materiais e Métodos
isolados bacterianos
Os isolados bacterianos purificados incluídos neste estudo foramisoladas
de culturas de sangue clínico, e estavam sendoarmazenados como
estoques glicerol a 70 ° C. Estas bactériasnão se limitaram
a Magee Womenâ € ™ s Hospital (MWH), masinclui os de outro hospital
regional, bem como um de outro estado. Todos os isolados foram
identificados através da análisefenotípica convencional.

População paciente
Os pacientes neste estudo incluiu recém-nascidos internados emHospital da
Mulher Magee (MWH) UTIN para avaliações sepsebacteriana. Cada
avaliação sepse neonatal incluiu uma coleta de sangue para a cultura e uma
contagem completa do sangue(CBC). As porções descartadas de sangue
total remanescente após análise CBC foi usado para análise
de PCR 16S rRNA, e, se PCR-
positivo, para pyrosequencing. A MWH InvestigationalReview Board aprovou
este estudo.

A cultura de sangue e identificação fenotípica

O laboratório clínico usa o BACTEC 9240 (Becton Dickinson, Sparks, MD),
para cultura de sangue. Este é um sistema de cultura de sangue automatizado
que usa um sensor fluorescente para a detecção de microorganismos. O CO2
é produzido pela metabolização ativamente microrganismos é continuamente
monitorada. Sangue total (0,5 a 1,0 ml) foi coletada de crianças na UTI
neonatal e pediátrica inoculado em amostras de resina, contendo, garrafas de
hemocultura (Peds Plus, Becton Dickinson). Os frascos foram incubados
imediatamente após a recepção no laboratório de microbiologia, de acordo com
a recomendação do fabricante.
Líquido de um frasco de cultura de sangue que foi sinalizada pelo instrumento
BACTEC 9240 para o crescimento bacteriano detectável foi de Gram e
repicadas em placas de ágar apropriado baseado em cultura. Colônias
purificadas foram analisadas tanto por um sistema de identificação automática
(MicroScan Dade, West Sacramento, CA) ou usando o reagente de teste
adequado individuais necessários para a identificação fenotípica.
Coleta de Amostras de sangue total, pré-enriquecimento, e Preparação para a
PCR para coleta da amostra de análise e processamento foram descritos
previously.17 Resumidamente, a parte descartada de sangue total coletado em
um tubo de tamanho pediátrico top roxo (EDTA) para análise CBC foi usado. O
volume de sangue média foi de 250? L, mas variou entre 100? L para 600?
L. Estas amostras são coletadas rotineiramente em qualquer uma das duas
maneiras, direto de uma linha arterial, ou de um calcanhar. O método utilizado
para coletar amostras de sangue do indivíduo neonatal para este estudo não foi
observado. Após o volume da amostra foi observado, o conteúdo do tubo foi
adicionado diretamente a 4 ml de caldo tripticase soja (TSB; Invitrogen,
Carlsbad, CA). O TSB inoculado foi incubado a 37 ° C com agitação contínua
entre 5 horas e 10 horas. O material celular foi peletizada a 4 ° C durante 5
minutos a 13 mil? g. Células vermelhas do sangue foram lisadas com 1 ml 4 °
C tampão que consiste em sacarose 0,32 mol / L, 10 mmol / L Tris-HCl, pH 7,5,
5 mmol / L MgCl2, e 1% Triton X-100. Células intactas foram tratados durante
30 minutos a 37 ° C com 100? L tampão fosfato (PBS), contendo 50 unidades
mutanolysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), antes da digestão com 10? L 10
mg / ml proteinase K ( PK) (Sigma) por 30 minutos a 70 ° C. O PK foi
desativado na amostra por aquecimento a 100 ° C por 10 minutos.

Preparação do DNA bacteriano purificado

Colônias de Análise de PCR
Um ciclo estéril foi tocado para uma colônia de bactériaspresentes
no indivíduo uma placa de agarose. As bactérias no
circuito foram emulsionados em 85 l PBS e 5 l
(50 unidades)mutanolysin (Sigma), antes de incubação a 37a ° C por 30
minutos. A esta mistura, 5 l de 10 mg / ml PK (Sigma) e 1 l de sulfato dodecil de
10% de sódio (SDS) (Sigma) foram adicionados antes da incubação durante 30
minutos a 37a ° C, seguido de aquecimento a 95A ° C por 10 minutos. A 1 -
volumel do DNA bacteriano preparado foi adicionado a 99 l de mestre
mistura para amplificação do alvo rRNA 16S 380-bp. 16S
rRNAEnsaio PCR 16S rRNA O ensaio de PCR,
que detectaconsistentemente 10-50 unidades formadoras de colônias / mlfoi
previamente described.17 Resumidamente, os primers bem
caracterizados, RW01 e da DG-74,22 foram usados para amplificar
um fragmento 380-bp (pb)que reside dentro de uma região conservada do gene
bacteriano16S rRNA, que é ladeada por variável regiões V8 e V9. O master
mix composto de 10 mmol / L Tris-HCl, pH 8,3, 50 mmol / LMgCl2,
200 mol / L de cada dATP, dCTP, dUTP e dGTP, 1
unidade (U) da UNG (Applied Biosystems, Foster City, CA), 25mol / L de cada
primer e 2,5 U Taq polimerase (Promega, Madison, WI). Dez l da amostra
preparada foram adicionados a 90 l de mix master. Após 30 ciclos de
amplificação 20 l de material foram analisados por eletroforese em gel
de agarose. Ogel de etídio manchada foi avaliada para a presença do
fragmento de DNA 380-bp em comparação com um 100-bppadrão de
peso molecular escada (BioWhitaker, Rockland, ME).

Tabela 1. Sequências de DNA dos Primers Vários ou sondas

utilizadas para amplificação PCR 16S rRNA, Pyrosequencing, oureações de
hibridização Dot Blot

serve como uma sonda universal reconhecendo organismos tantogram-

*,
positivas e gram-negativas; †, serve como uma sondagram-
positivas específicas, ‡, serve como uma sondagram-negativas específicas.

Hibridação DNA Dot Blot

DNA análise dot blot hibridação foi realizada em todas as amostras PCR-
positivos para determinar a natureza das bactérias ampliado em comparação
com os resultados Gram(Tabela 1). Etiquetadas individualmente sondas de
oligonucleotídeos, RW03 (gram positivo), DL04 (gram negativos)
e RDR245 (universal sonda), todos descritos anteriormente, 22foram
utilizadas para hibridar com os desnaturados produtoPCR de 380 bp como
anteriormente described.17

ABI 3100 Sequenciamento Full-Length do 380-bp 16S rRNAAmplicon

Os amplicons de 380 pb a partir de isolados vários de cadagrupo de
bactérias listadas na Tabela 2 foram totalmenteseqüenciados usando
o instrumento ABI 3100 (Applied Biosystems) PCR eficiência de
amplificação de cada amostrafoi avaliada por eletroforese em gel
de agarose antes deseqüenciamento. Uma vez que a
amplificação adequada foi documentada, o amplicon de 380 pb foi
purificado usando umaunidade de filtro Centricon centrífuga
(Millipore, Billerica, MA). ODNA purificado (10 ng / l) foi seqüenciado de acordo
com a € ™s Manufacturera recomendação. O RW01 e DG74 primers foram
usados como primers de seqüenciamento em reações distintas para
prestar seqüências fulllength de ambas as vertentes.Alinhamento da
seqüência foi realizada
utilizando softwareSequencher (Gene Codes Inc., Ann Arbor, MI).

Pyrosequencing Reação
Pyrosequencing requer que o DNA a ser seqüenciado conter uma etiqueta
de biotina. Para este fim, 10 l de pré-
amplificadaunlabeled 16S, rRNA PCR master mix foram re-amplificadas para
incorporar uma cartilha RW01 biotinilado. A 40 - volume l de
cadaproduto rotulado PCR 380-pb foi purificado por Pyrosequencing Reação
Pyrosequencing requer que o DNA a ser seqüenciado conter uma etiqueta de
biotina. Para este fim, 10? L de pré-amplificada unlabeled 16S, rRNA PCR
master mix foram re-amplificadas para incorporar uma cartilha RW01
biotinilado. A 40 -? L de volume de cada produto rotulado PCR 380-pb foi
purificado por imobilização em gotas de streptaviden revestido sepharose (3 l?)
(Amersham, Piscataway, NJ) no buffer fornecido pelo recozimento Biotage
(Uppsala, Suécia). A vertente unlabeled foi dissociado e descartados usando
desnaturação alcalina de acordo com as instruções do fabricante. A ferramenta
de preparação pyrosequencing vácuo foi usado para realizar a lavagem (10
mmol / L de acetato de Tris, pH 7,6) e talão passos transferência. A vertente
ligada talão biotinilado foi adicionado a uma placa de microtitulação de 96
poços
juntamente com tampão de recozimento eo primer de sequenciamento
complementares (RDR 245) .22 A placa foi aquecida a 95 ° C por 2 minutos e
deixar arrefecer na bancada, momento em que o primer pode anneal com seu
alvo.Pyrosequencing análise foi realizada utilizando uma PSQ96 MA e o kit de
reagentes SQA (Biotage) e um programa de dispensação de nucleotídeos
cíclicos de acordo com o manufacturer.20 A placa contendo o produto recozido
foi colocado no Sistema de 96MA PSQ (Biotage), onde a reação
seqüenciamento direto ocorreu. A reação pyrosequencing usa um sistema em
cascata de 4 de enzimas para produzir uma luz visível que é lido por uma
câmera CCD. A luz detectada pela câmera é exibida como picos, com a altura
do pico é proporcional ao número de bases de um dNTP específicos que foram
incorporados durante a reação. Todas as quatro bases são adicionados
individualmente, uma base de dNTP em um momento com o nucleotídeo
unincorporated sendo destruídos enzimaticamente antes do dNTP seguinte é
adicionada (dATP, dCTP, dTTP, dGTP e finalmente). O computador oferece ao
leitor tanto uma figura, referido como um pyrogram, e uma seqüência baseada
em texto. As bases resultantes da seqüência gerada a partir de pyrosequencing
foram comparados com o mesmo trecho de
seqüência nas diferentes seqüências de genes bacterianos 16S rRNA gerados
por nós usando o ABI 3100 de instrumento e com a encontrada no GenBank,
banco de dados EMBL Nucleotide Sequence, eo DNA de Banco de Dados
Japan23, 24 usando o BLAST tool25 no Centro Nacional de Informações sobre
Biotecnologia ( NCBI). Seqüências foram alinhadas utilizando software
Sequencher (Gene Codes Inc.).

Resultados
Full-Length Sequence do Amplicon 380-bp Gerado a partir de isolados clínicos
foi virtualmente idênticos àqueles mesma seqüência bacteriana, que
ocorrem nos bancos de dadosQueried Duas a três bactérias de cada
grupo listados na Tabela 2 foram analisados utilizando o ABI 3100 para obter a
sua 16SrRNA fulllength 380-bp seqüência. Isto incluiu o
seguinte: GBS,Enterococcus sp, S. pneumoniae, S. aureus,
Staphylococcuscoagulase-negativo, E. coli, Klebsiella oxytoca,
Enterobacteragglomerans, E. asburiae, E. Gergovia,
K. pneumoniae, Proteusmirabilis, Serratia. marcescens, E. cloacae,
E. aerogenes, p.vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae e
Listeria monocytogenes. O objectivo deste exercício foi o de comparar a
seqüência de DNA 380-bp obtidos em isoladosclínicos para as presentes
nos diversos bancos de dadosconsultados no mesmo organismo. As
seqüências de 380 pb DNA presente nas três bases de
dados consultadas foram praticamente idênticos aos gerados usando isolados
clínicos (dados não mostrados). A base não-idênticos rara estava
sempre fora dessas regiões que representam primers, sondas e, mais
importante, o informativo15 bases que haviam sido identificadas. Esta
região de base 15 mostraram identidade de seqüência completa dentro de um
grupo de bactérias, independentemente de eles eram de isolados clínicos ou
aqueles que foram seqüenciados para a apresentação de banco de
dados. Esta região base de 15reside dentro de uma região constante
do gene rRNA 16S, que é ladeada pela
variável regiões V8 e V9. Esta importante descoberta permitiu que esta região
a ser alvo de uma comparação mais ampla com maior número de isolados
clínicos.

Seqüência de DNA Gerado por Pyrosequencing

Usando RDR Primer 245 foi útil na diferenciação entre os diversos grupos
de bactérias

Depois de encontrar a identidade seqüência completa entre um pequeno

número de isolados clínicos e as seqüências de bactérias presentes em bancos
de dados, passamos a examinar um número muito maior de isolados
clínicos. Um total de 643 isolados clínicos foram analisados
por pyrosequencing para os 15 seqüências de bases imediatamente a
jusante do primer 245 RDR. Por causa da diversidade adequada, as
bactérias analisadas aqui vieram não só do nosso hospital, mas de um
outro hospital na região, bem como de um em outro estado dentro os EUA. A
identidade destes isolados bacterianos purificados foi
determinada fenotipicamente pela cultura convencional baseada em métodos.
A RDR 245 oligonucleotídeo serviu como o primer de sequenciamento na
reação pyrosequencing. RDR 245 foi escolhido com base em nossa
experiência anterior com ele como uma sonda universal para a detecção
de uma ampla diversidade de 380-bp 16S rRNA amplicons em Southern
blotassays.17, 22 Tabela 2 ilustra os 15 padrões de base
informativa seqüência gerada a partir de 643 diferentes isolados
clínicos que entre os isolados relacionados foi idêntico. Esta constatação nos
permitiu diferenciar amplamente diversos grupos de bactérias comumente
associados com sepse bacteriana neonatal. Isto incluiu a capacidade de
distinguir entre o Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Listeria sp,
Pseudomonas sp., Entéricas bastonetes gram-negativos e Haemophilus sp.

Pyrosequencing forneceu informações úteis sobre a identidade

do Amplicon Gerado por PCR de amostras de sangue total Neonatal

PCR 16S rRNA é rotineiramente realizada em sangue total neonatal que foi
pré-enriquecido em TSB por 5 a 10 horas. Ao longo do tempo,
 temos detectado DNA bacteriano em 15amostras clínicas. Estes foram
posteriormente analisados por pyrosequencing, cujos resultados foram
comparados à identificação bacteriana obtida por métodos de cultura de base e
pelo DNA dot blot hibridação resulta (380-bp amplicon). A Tabela 3 ilustra esta
comparação.
O pyrosequencing classificações das bactérias foram consistentes com os
resultados de identificação da cultura e com os resultados
obtidos usando dot blot hybiridzation para todos os 15PCR-positivo, cultura
positiva amostras de sangue neonatalanalisados. Figura 1, de A
a D ilustra pyrograms representante e as seqüências associadas gerada
em nosso laboratório em quatro grupos amplamente diversificado de bactérias
que são comumente isoladas de hemoculturas neonatal. Essas seqüências são
idênticos aos encontrados na Tabela 2 e ilustrada a utilidade desta base
de 15 impressões digitais gerados por pyrosequencing para a
diferenciação entre os diversos grupos de bactérias.

Discussão
Detecção de sepsis neonatal rapidamente é crucial, pois é uma condição com
risco de vida. Utilizando uma abordagem que poderia ser mais rápida do que a
cultura padrão e técnicas de identificação para a detecção de sepsis neonatal
seria altamente desejável. Uma abordagem de base molecular para a detecção
de um alvo altamente conservadas, como o gene rRNA 16S, que está presente
entre todas as bactérias associadas com a septicemia seria útil. Estendendo a
abordagem para além de fornecer um "positivo ou negativo" resultado para
incluir um nível de discriminação entre as bactérias seria fornecer informações
valiosas para os médicos a tomada de decisões de gerenciamento terapêutico
para o recém-nascido. Aplicando essa abordagem à população neonatal é mais
simples do que em uma população de pacientes adultos. Há um número
bastante limitado de bactérias associadas com sepse neonatal, em
comparação aos adultos.Isso nos fornece um número mais limitado de
comparações seqüência que precisamos estar preocupados. É preciso também
perceber que há mais de um nível de especificidade incorporado esta
abordagem. O primeiro nível é baseado no reconhecimento da RW01 e DG74
primers para gerar um produto 380-bp. O segundo nível de especificidade
exige o reconhecimento dos 245 RDR primer. É dentro desse contexto que a
15 bases de seqüência de DNA precisam ser consideradas.
Com base nos dados aqui apresentados, conseguimos demonstrar a nossa
capacidade de combinar 16S rRNA ensaio de PCR e pyrosequencing para
diferenciar entre as bactérias amplamente diversificada comumente associados
com sepse neonatal em comparação com a identificação da cultura-based.Esta
informação, se fornecido ao médico em tempo hábil, permitiria que ele / ela
adequadamente adaptar a antibioticoterapia a ser dada à criança infectada
mais cedo do que é actualmente possível usar a cultura convencional e
estratégias de identificação, que exigem 48 horas para 72 horas
para completa. Em casos confirmados em laboratório de sepse neonatal
(sepsis true) no Hospital Magee Mulher o tempo médio para detecção de
crescimento bacteriano em frascos de cultura de sangue foi de 18 horas
(variação de 11 a 28 horas), enquanto o tempo médio para identificação das
purificada isolar foi de 49horas (intervalo de 23-73 horas). Atualmente os
médicos não podem alterar as terapias com antibióticos a ser dada aos recém-
nascidos suspeitos de serem séptico após a identificação bacteriana é
finalizado. Para aqueles com casos clinicamente suspeitos de sepse, as
culturas não-crescimento de sangue são finalizados após 5 dias de
incubação. Embora esta abordagem combinada de PCR para detectar e
pyrosequencing sepse bacteriana não fornece especiação bacteriana definitivo
ou teste de sensibilidade a antibióticos, que fez demonstram maior poder de
discriminação do que o resultado inicial grama mancha no líquido de uma
garrafa de sangue positivo, ou um resultado de Southern blot do 16S rRNA
fragmento amplificado pela PCR. A abordagem de realizar rápida,
seqüenciamento curto ler em um fragmento amplificado pela PCR poderia
fornecer o médico com informações valiosas sobre a etiologia do
microorganismo mais cedo do que cultura, permitindo-lhes tomar decisões mais
informadas, mais cedo sobre o tipo (s) de antibióticos para dar ao
bebê. Eliminando a necessidade de dar ao recém-nascido um ineficazes ou
desnecessárias antibiótico de amplo espectro mais cedo ajudaria a reduzir o
risco de destruir a criança é normal da flora intestinal e / ou promover
resistência aos antibióticos. Reconhecemos a importância de tentar excluir os 5
a 10 horas etapa de enriquecimento TSB do nosso protocolo atual, se possível,
e estamos perseguindo esse objetivo. Os primeiros resultados aqui
apresentados mostram a promessa como um meio de rápida detecção e
diferenciação entre as bactérias comumente associados com sepse
neonatal.No entanto, muitos mais PCR positivos amostras de sangue total
deverão ser analisados antes que possa ser comprovado.

Figura 1. A-D: pyrograms Representante e à impressão digital de

base informativa 15 molecular gerado a partir de
bactériasrepresentante associados com sepse neonatal.

Tabela 3. Comparação dos resultados gerados peloPyrosequencing, Cultura

e Dot Blot para hibridizaçãoidentificação bacteriana de 15 amostras de sangue
neonatal

Microscan ou indivíduo reações bioquímicas; †, reatividadehibridização

com RW03 (gram-positivos), DL04 (gram-negativas) e RDR 245 (universal)
sondas, ‡, primeiros 15 bases de seqüência gerado
pelopyrosequencing usando a RDR 245 sonda como o primer de
sequenciamento; GBS, Grupo B Streptooccus;
CoNS, coagulase-negativo Staphylococcus sp.

Tabela 2. Padrões seqüência dos primeiros 15 Bases de DNAGerado

por Pyrosequencing Usando a RDR 245 PrimerSeqüenciamento

n, número de isolados testados em um grupo.

A seguir representa a repartição dos tipos de bactérias dentro de um único
grupo; (n) representa o número de um tipo específico de bactérias
incluídos.
* Streptococcus sp;. GBS (119), GAS (10), Enterococcus sp.(49),
S. pneumoniae (3).
â € Staphylococcus sp;. S. aureus (70), Staphylococcuscoagulase-
negativo sp. (135).
â € ¡Listeria sp. consistiu de Listeria monocytogenes (32).
 § Pseudomonas sp. consistiu em Pseudomonas aeruginosa(19).
 ¶ entéricos
Gram negativos haste I; E. coli (69), Klebsiellaoxytoca (22), Enterobacter agglo
merans (1), Enterobacterasburiae (5), Enterobacter Gergovia (2).
Entéricas gram negativas haste II; Klebsiella pneumoniae (34),
Proteus mirabilis (11), Serratia marcescens (14), Enterobactercloacae (5), Enter
obacter
aerogenes (3), Proteus vulgaris (1).
** Haemophilus sp. consistia de Haemophilus influenzae (39).
Diferenciando rRNA 16S de bactérias por 107 Pyrosequencing
JMD Fevereiro de 2005, vol. 7, No. 1