Universidade Federal de Ouro Preto

Instituto de Ciências Exatas e Biológicas

Departamento de Ciências Biológicas
Biologia Molecular – CBI 613

Detecção simultânea de Neisseria

meningitidis, Haemophilus influenzae e
Streptococcus pneumoniae em casos
suspeitos de meningite e septicemia usando
PCR em tempo real

Dilaina Santos
Rafaela Alves
Letícia Pereira
Tatiane Avelar
Thaís Teixeira

Ouro Preto, 19 de julho de 2017

 MENINGITE BACTERIANA
Provoca a inflamação do
tecido que envolve o
cérebro e a medula.

O contágio acontece através

do contato com gotículas de
saliva do indivíduo infectado.

Sequelas: alterações
cerebrais, surdez, epilepsia,
paralisia motora, dificuldade
de aprendizagem.
 Os três principais agentes patogênicos que causam a
meningite bacteriana são:
SEPTICEMIA
A septicemia é envenenamento do
sangue que pode surgir em qualquer
pessoa que tenha uma infecção
localizada que não é tratada.

Pode ser causado pela mesma bactéria

que causa a meningite.

Pode-se contrair meningite e

septicemia ao mesmo tempo.
 reagentes
comercialmente
disponíveis, o
que frustrou as
tentativas de
Influência
explorar o gene
do rRNA16S
para
desenvolver um
teste de PCR
Métodos
• altamente não
sensível como
culturais para a
PCR
detecção foram
empregados de
universal e
Método
demonstraram
causas
confirmar casos
bacterianas da
adicionais
doença. da
doença.
• Métodos
tradicionais de
diagnóstico de
laboratório para
a identificação
Tempo
de patógenos
de meningite
bacteriana
levam até 36
horas ou mais.
O sistema de detecção de sequência 7700 (ABI, Warrington, Reino
Unido), conhecido como TaqMan, permite que a amplificação e a
detecção sejam realizadas ao mesmo tempo em um sistema de
tubo fechado. O monitoramento contínuo em tempo real de PCR
permite o rápido processamento de um grande número de
espécimes em um formato altamente padronizado.
MATERIAIS E
MÉTODOS
 ESTIRPES BACTERIANAS E MÉTODOS
DE CULTURA 157 amostras de
plasma, 36 amostras
de CSF, 31 amostras
Doença de soro e de sangue
meningocócica total e 8 amostras de
esguicho de garganta

6 amostras de CSF, 2
Doença H. amostras de plasma e
Sensibilidade influenzae 1 amostra de heparina
de sangue total

23 amostras de CSF e
Doença 13 amostras de soro
pneumocócica ou plasma de diversas
fontes
Especificidade
Determinada usando DNAs genômicos de bactérias e vírus
de Neisseria

Cepas bacterianas do Laboratório de Microbiologia Clínica no

Laboratório de Saúde Pública de Manchester

Estirpes de S. pneumoniae da Coleção Nacional PHLS de

Culturas

Vírus do herpes simplex e o vírus da varicela-zoster isolados de

cultura de tecidos, de amostras de sangue PCR-positivas e vírus
da hepatite B de amostras de soro anti-positivos

DNA genômicos humanos extraídos de 46 adultos saudáveis

PROJETO DE PCR
 A tabela a seguir mostra a sequência e
posição dos iniciadores e sondas de
oligonucleotideos.
 • Baseados nas leituras de
fluorescência tomadas pela
máquina TaqMan, que são
usadas para calcular uma
leitura basal para cada reação; tempo real
• O valor do limiar de ciclo (CT) é
o número do ciclo de PCR (de
de PCR em
45) no qual o sinal fluorescente
medido excede um limiar de
Resultados
fundo calculado que identifica a
amplificação da sequência alvo;
• Amostra negativa se não
houver aumento no sinal de
fluorescência após 45 ciclos.
AMPLIFICAÇÃO
COMPONENTES DE PCR E PERFIL DE
 Os achados clínicos sugeriram meningite e/ou
septicemia fazendo parte do diagnostico diferencial.
Essas amostras foram extraídas por DNAzol e
armazenadas a 20ºC durante 2 a 8 meses após o teste
inicial de PCR meningocócica.

Qualquer resultado PCR positivo foi confirmado por

testes com conjunto de iniciadores.

Quando não foi possível confirmar um resultado

multiplex, o espécime original foi extraído e testado
novamente usando o primer single na tentativa de
confirmar o resultado inicial.
 GenBank
para as
sequências
relatadas nucleotídeos
aqui são os
As diferenças
• seguintes: N.
sequência de
entre
meningitidis os Acesso à
resultados
ctrA; H.
obtidos com o
influenzae
conjunto
bexA ; E S. de
iniciadores ctr
pneumoniae
A
ply. de N.
meningitidis e
com o estatística
conjunto
relatado
Análise
anteriormente
foram
analisados ​
para
significância OUTROS DADOS...
estatística
usando o
teste de
RESULTADOS
 ctrA
AVALIAÇÃO DO ENSAIO. (I) N. MENINGITIDIS PCR

A sensibilidade da PCR ctrA meningocócica foi

de 88,4% quando testada contra amostras de casos de
doença meningocócica confirmados pela cultura.
 ctrA
AVALIAÇÃO DO ENSAIO. (I) N. MENINGITIDIS PCR

Não houve diferença na sensibilidade do

conjunto de iniciadores de ctrA quando comparados nos
formatos multiplex e single-set de iniciadores usando
DNA de N. meningitidis diluído em série.
(II) PCR DE H. INFLUENZAE BexA

Não houve diferença na sensibilidade dos conjuntos de

iniciadores bexA quando comparados nos formatos multiplex e
single-set de iniciadores usando H diluído em série DNA de
influenzae.
(III) PCR DE CAMADA DE S. PNEUMONIAE
Não houve diferença na sensibilidade do conjunto de
iniciadores de camadas quando comparado nos formatos
multiplex e single-set-primer usando o DNA de S.
pneumoniae diluído em série.
A sensibilidade à PCR da camada de
S. pneumoniae foi avaliada utilizando
36 amostras de casos confirmados por
cultura de doença de S.
pneumoniae apresentando uma
sensibilidade geral de 91,8%.
AMPLIFICAÇÃO DE MÚLTIPLOS
OBJETIVOS
Das três amostras PCR positivas para N. meningitidis e S.
pneumoniae, duas foram confirmadas como infecções de N.
meningitidis por cultura.
AMPLIFICAÇÃO DE MÚLTIPLOS
OBJETIVOS
Ao testar amostras de cultura-negativas, os
iniciadores de N. meningitidis desenvolvidos
para uso no ensaio multiplex foram
significativamente mais sensíveis (P <0,0001)
do que o conjunto de
iniciadores ctrA previamente relatados.

Isso representou uma melhora na taxa

de detecção de meningocócitos de 2,9%
(13,0 versus 15,9% das amostras
de PCR-positivo total), ou 87 casos
adicionais identificados por PCR
isoladamente. Por outro lado, 62
resultados previamente positivos para
a PCR ctrA não foram detectados
usando o conjunto
de implantes multiplex ctrA no teste
repetido.
AMPLIFICAÇÃO DE MÚLTIPLOS
OBJETIVOS
No total, 49 amostras de 736
(6,6%) que foram positivas pelo
ensaio multiplex não foram
confirmadas pela PCR apropriada
de iniciador único, dos quais 46
(93,9%) tinham um valor de CT
superior a 34 de 45 PCR Ciclos.

Vinte e cinco amostras de PCR

positivas para a tela não
podem ser testadas ainda
mais devido à quantidade de
espécime insuficiente.
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO

Devido à impossibilidade de desenvolver

um PCR universal sensível e específico,
desenvolveu-se um PCR multiplex (tubo
único) tendo como base N. meningitidis, S.
pneumoniae e H. influenzae - responsáveis
por > 80% dos casos de meningite
bacteriana.
 O PCR pneumocócico desenvolvido foi
específico para os 23 sorotipos pneumocócos,
oferecendo um alto nível de sensibilidade. As 4.113
amostras testadas foram de pacientes clinicamente
suspeitos de terem doença meningocócica.

48 amostras de 46 casos foram confirmadas

como PCR pneumocócica positiva. Estes não foram
identificados pela cultura de laboratório, enfatizando
o impacto benéfico da inclusão de PCR
pneumocócica na estratégia de teste de diagnóstico
de rotina.
CONCLUSÃO
CONCLUSÃO
 Os dados sugerem que 1% de todos os casos de
meningite são devidos a mais de um patógeno, no
entanto, os métodos de laboratório tradicionais nem
sempre podem identificar múltiplos agentes patogênicos
em uma única amostra clínica, uma vez que a
identificação da cultura é baseada no organismo
predominante e pode ser influenciada pelo uso de meios
de cultura seletivos.

 Os ensaios de PCR mostraram amplificar vários

agentes patogênicos, mas esses ensaios dependeram
de uma abordagem de PCR alinhada para uma melhor
sensibilidade.
 Nos casos em que foi impossível confirmar os resultados
múltiplos positivos da PCR, o número do ciclo para
atingir o valor do limite inicial foi maior que 34 em 93,9%
dos espécimes.
 Experimentos de titulação de plasmídeos para a geração
de uma curva padrão demonstraram que a detecção de
amostras em torno do ciclo 35 representa uma entrada
alvo de menos de 10 cópias, se aproximando dos limites
de detecção da PCR.
 Ao utilizar a tecnologia TaqMan disponível, a introdução
de uma PCR multiplex permite uma identificação rápida e
um alto rendimento de amostras (130 min para 96 ​
espécimes), com um custo adicional modesto para
iniciadores e sondas em cada reação.
 A PCR multiplex demonstrou que o teste de um grande
número de espécimes culturais negativos anteriormente
fornece informações sobre a incidência de infecções
meningocócicas, H. influenzae e pneumocócicas em
espécimes clínicos originalmente referidos para testes de
PCR meningocóca.
 O potencial para orientar os clínicos para a terapia
antimicrobiana mais adequada e o gerenciamento do
paciente é melhorado.
 A inclusão da PCR multiplex no regime de rastreamento
de diagnóstico molecular de rotina proporciona um teste
rápido e robusto para o diagnóstico não cultivado,
melhorando a verificação do caso de meningite e
septicemia.