Você está na página 1de 5

J. Bras. Nefrol.

1997; 19(4): 381-385

381

Anlise comparativa da determinao de antgenos HLADR por mtodos sorolgicos e por PCR-SSP
Maria Lcia C. Marin, Anna Carla Goldberg, Hlcio Rodrigues, Cludia Rosales, Carlos Srgio Viggiani, Marly A. Oliveira, Jorge Kalil

O objetivo deste trabalho foi comparar a determinao dos antgenos HLA-DR por sorologia, utilizando-se A) anti-soros policlonais ou B) anticorpos monoclonais, com a determinao em nvel de DNA em amostras de sangue de receptores e doadores de rim e medula ssea. Observamos que os anticorpos monoclonais apresentam maior concordncia com o PCR-SSP. Podemos concluir que as determinaes sorolgicas tm menor preciso, acarretando aproximadamente 48% de imprecises com antisoros policlonais e 21% com anticorpos monoclonais. O PCR-SSP permite melhor definio da compatibilidade HLA-DR entre receptor e doador,

que

ser,

em

ltima

anlise, adjuvante de melhor sobrevida do enxerto.


Laboratrio de Imunologia de Transplantes, INCOR-HCFMUSP Endereo para correspondncia: Anna Carla Goldberg Av. Dr. Enas de Carvalho Aguiar, 500, 30 andar CEP: 05403-000 So Paulo, SP Tel./Fax (011) 282-9350

HLA, Antgenos de Classe II, PCR, Sorologia, T i p i f i c a o Molecular HLA, Class II Antigens, PCR, Serology, Molecular Typing

Introduo
O Complexo Principal de Histocompatibilidade (CPH) codificado no cromossomo 6 humano, contm, entre outros, os genes do sistema HLA. Tais genes codificam para

estruturas de superfcie celular altamente polimrficas, os antgenos HLA. Inicialmente definidos como antgenos de transplantao por Dausset em 1958, 1,2 o seu papel na rejeio ao enxerto hoje incontestvel, sendo alvo primordial da resposta alognica. Estes antgenos esto intimamente ligados aos processos de defesa imunolgica do organismo. Os antgenos de classe I tm seus produtos expressos em praticamente todas as clulas do organismo. Uma outra parte destes genes do sistema HLA codifica para os antgenos HLA de classe II que so expressos, normalmente, nas clulas imunocompetentes. A estrutura e funo destas duas classes de protenas em muito se assemelham. O reconhecimento de molculas estranhas ao organismo (no prprias) feito em associao com os antgenos de histocompatibilidade. A apresentao destes produtos possibilitada pela estrutura caracterstica das molculas HLA que abriga os peptdeos, isto , fragmentos de protenas que sero apresentados aos linfcitos. Estas protenas (antgenos) podem tambm originar-se das prprias molculas HLA do doador, dando origem resposta alognica. A parte externa da molcula HLA acumula a maior parte da variablidade ou polimorfismo presente neste sistema. este polimorfismo que define o nvel de compatibilidade

382

J. Bras. Nefrol. 1997; 19(4): 381-385

M. L. C. Marin et al - HLA-DR: comparao entre sorologia e PCR-SSP

entre doador e receptor. Estas diferenas devem ser identificadas para a escolha adequada de um doador. A determinao dos antgenos HLA tem sido realizada, na maior parte dos laboratrios, atravs do mtodo sorolgico, utilizando-se a tcnica de microlinfocitotoxicidade mediada por complemento. Esta tcnica encontra-se atualmente aperfeioada e valendo-se de reagentes biolgicos padronizados, oferecidos por companhias especializadas. Esses reagentes biolgicos so anti-soros policlonais ou anticorpos monoclonais que reconhecem as especificidades HLA-DR e soro de coelho, como fonte de complemento para a lise celular. Estes reagentes apresentam uma limitao importante, principalmente no que se refere a sua aplicabilidade populao brasileira. Os anti-soros policlonais utilizados so, predominantemente, de origem caucaside, dificultando a definio dos antgenos oriundos das outras etnias que compem a nossa populao. Neste estudo, procuramos avaliar a eficincia da determinao dos antgenos HLA-DR pela tcnica da microlinfocitotoxicidade, que avaliada por porcentagem de lise celular quando da interao antgeno-anticorpo em presena de complemento. Como teste padro, utilizamos a reao de amplificao em cadeia denominada PCR. Realizada a partir de DNA obtido de amostras de sangue, trata-se de um processo de ampliaco gnica que utiliza iniciadores (primers) de seqncias especficas (SSP) e uma enzima DNA polimerase (Taq polimerase), sendo a ampliao obtida atravs de um termociclador. Trata-se de uma tipificao de baixa resoluo que fornece resultados equivalentes ao mtodo sorolgico, podendo reduzir a incidncia de antgenos no definidos (brancos) que poderiam caracterizar uma homozigose.3 O PCR-SSP foi principalmente aplicado a amostras de doadores e receptores candidatos a transplante vivo-parente de medula ssea e rim.

provenientes destes doadores. 2) ausncia de amostra do doador: esta amostragem compreendeu 17 e 27 casos, respectivamente, do grupo A e do grupo B. 3) ausncia de amostra do receptor: o caso das amostras de doador cadver que perfizeram 3 e 11 casos dos grupos A e B, respectivamente.
Extrao de DNA

A extrao de DNA foi realizada pela tcnica rpida com DTAB/CTAB, 4 onde a camada de leuccitos obtida a partir de 5 ml de sangue misturada com 1 volume de DTAB 12% (DTAB 12%, NaCl 2,25%M, Tris 150mM pH8,6, EDTA 75mM) e incubada por 5 minutos a 68o C. Dois volumes de clorofrmio so adicionados, seguindo-se vigorosa agitao. Aps centrifugao por 2 minutos a 10.000 rpm, recupera-se o sobrenadante ao qual so adicionados 2 volumes de CTAB 0,5% (CTAB 5%, NaCl 0,4M), homogeneizando-se em seguida para obter-se o precipitado DNA/CTAB. Aps nova centrifugao por 2 minutos a 10.000 rpm, o precipitado ressuspendido em 300 ml de NaCl 1,2 M e 750 ml de etanol 99,5%. Centrifuga-se por 2 minutos a 13.000 rpm. Nova lavagem e centrifugao so realizadas com etanol 70%.
Microlinfocitotoxicidade

Materiais e Mtodos
As amostras de sangue analisadas neste estudo foram coletadas de doadores e receptores candidatos a transplante de medula ssea e rim. Apenas 13 amostras do total foram provenientes de doadores cadvericos. Foram analisadas 59 determinaes feitas com anti-soros policlonais (grupo A) e 79 feitas com anticorpos monoclonais (grupo B). Foram obedecidos os seguintes critrios de escolha: 1) qualidade da amostra de sangue: foi dada preferncia a amostras de doadores normais de medula e de rim intervivos. No grupo A, 39 e no grupo B, 41 das amostras eram

Para a separao das subpopulaes celulares T e B foi utilizada a metodologia do cotonete de l de nylon, 5 que se baseia na propriedade das clulas B de aderirem l de nylon. O mtodo da microlinfocitotoxicidade se baseia na reao especfica de anti-soros contra os antgenos HLA presentes na superfcie das clulas. A reao realizada em microplacas com poos onde esto contidos os anti-soros. A suspenso linfocitria a ser tipificada adicionada a cada poo, seguindo-se uma incubao. Posteriormente, adicionase soro de coelho como fonte de complemento para desencadear lise celular onde houver reao antgenoanticorpo,6 sendo esta visualizada pela adio de corante vital Eosina Y. Para determinao dos antgenos HLA-DR foram utilizadas microplacas de Terasaki com 72 poos contendo 3 a 4 anti-soros anti-HLA para cada especificidade. Foram utilizados anti-soros mono e poliespecficos perfazendo um total de 70 anti-soros policlonais (C-six Diagnostics, Inc., Mequon, WI, EUA) ou anticorpos monoclonais (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA, EUA), para antgenos de Classe II.

J. Bras. Nefrol. 1997; 19(4): 381-385

383

M. L. C. Marin et al - HLA-DR: comparao entre sorologia e PCR-SSP

Determinao de HLA-DR por ampliao seqncia-especfica (PCR-SSP)

Foi utilizado o mtodo descrito e modificado por Olerup e Zetterquist:7 o PCR-SSP (polymerase chain reaction with sequence-specific primers), - reao de polimerizao em cadeia com iniciadores de seqncias especficas. O mtodo de baixa resoluo, pois no detecta os alelos propriamente ditos, mas grupos de alelos, correspondendo no nvel molecular determinao feita pela sorologia. Em outras palavras, a determinao no fenotpica. Para isto, foram utilizados pares de primers ou oligonucleotdeos iniciadores especficos para ampliao de grupos de alelos dos genes DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5. Utilizamos 400 ng de DNA, tampo, dNTP 200 mM final, primers especficos e primers de controle interno 0,25 mM e 0,12 mM final, respectivamente, e 0,5 U de Taq polimerase (Cenbiot, RS, Brasil) em cada tubo. A reao de amplificao foi feita num volume final de 20 ml em um ciclador trmico PTC-100 (MJ Research, Inc., Watertown, MA, EUA) em 23 reaes com pares de iniciadores especficos e um controle negativo de ampliao, todos contendo um controle interno. A ampliao foi feita em 35 ciclos de 1 minuto a 94oC para desnaturao do DNA, 1 minuto a 60oC para anelamento dos iniciadores e 1 minuto a 72oC para extenso do fragmento ampliado. As bandas especficas de ampliao foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose a 1,2%.

Resultados e Discusso
Os resultados obtidos por PCR foram inequvocos em todas as amostras, havendo menos de 5 casos de antgenos no determinados (brancos) devido a homozigose ou por limitao do mtodo. Em apenas um caso houve determinao de antgeno na sorologia (grupo A) no detectado no PCR. Os resultados obtidos na sorologia foram analisados sob diferentes aspectos: a) no determinao do antgeno em relao ao PCR (considerado como branco), b) troca na determinao do antgeno em relao ao PCR e c) indefinio da subespecificidade ou split. Os antgenos e, entre parnteses as subespecificidades, detectados nos mtodos utilizados so o DR1, 2 (15 e 16), 3 (17 e 18), 4, 5 (11 e 12), 6 (13 e 14), 7, 8, 9 e 10. Na tabela 1a e 1b encontram-se os resultados destas comparaes. Os resultados mostram que os anti-soros policlonais apresentam menor discriminao de subespecificidades, problema este partilhado pelos anticorpos monoclonais no caso do DR3. Esta mesma dificuldade de discriminao se reflete no

aumento de brancos e de falsas determinaes antignicas nos grupos que contm subespecificidades (DR2,3,5,6). A forte reatividade cruzada observada entre antgenos dos grupos do DR3,5 e 6, tambm contribue no aumento do nmero de discrepncias observadas na determinao dos antgenos pela sorologia, quando comparadas ao PCR. A tabela 2 mostra exemplos tpicos ocorridos na determinao antignica destas amostras. O objetivo maior de se estabelecer a comparao das anlises dos antgenos HLA-DR foi a de avaliar a eficcia da tcnica da microlinfocitotoxicidade na determinao dos antgenos. Procuramos avaliar o uso tanto de anti-soros policlonais quanto de anticorpos monoclonais, utilizando como padro uma tcnica de resoluo equivalente, mas feita com o DNA das amostras. Podemos considerar esta ltima como padro, uma vez que esta identifica seqncias definidas de DNA, no havendo ampliao gnica quando a homologia dos iniciadores no for de 100%. Assim, a reatividade cruzada, um problema comumente encontrado no processo de identificao por mtodo sorolgico, deixa de existir. A reatividade cruzada foi a maior fonte dos erros por troca de determinao de antgenos, respectivamente 10,17% e 4,43% nos grupos A e B. Houve presena significante de antgenos no determinados (brancos): 15,25% no grupo A e 10,13% no grupo B. O restante das falhas foram devidas determinao da subespecificidade (indefinio ou erro): grupo A na porcentagem de 22,88% e no grupo B na porcentagem de 6,96%. Assim, o total de imprecises nos grupos A e B foi de 48,31% e de 21,52% respectivamente. Apesar de nossos resultados no terem sido analisados quanto freqncia dos antgenos determinados nas diversas etnias, pudemos observar uma melhor definio de antgenos mais raros na populao caucaside atravs do PCR-SSP. Exemplo disso, a especificidade DR18, de origem negride, e que apresentou 100% de imprecises em ambas as tcnicas sorolgicas. Desta forma, o mtodo de PCR-SSP foi por ns considerado padro, pois leva a uma clara definio dos splits (subespecificidades), um raro nmero de falhas na determinao dos antgenos, alm de oferecer uma confirmao, no nvel gentico, dos antgenos DR51,52 e 53.
Tabela 2 Exemplos de falhas ocorridas na tipificao HLA-DR Amostra Sorologia PCR-SSP 1 15, 3 15,13 2 1,X 1,15 3 11,X 11,14 4 15,13 15,17 5 6,X 1,11

384

J. Bras. Nefrol. 1997; 19(4): 381-385

M. L. C. Marin et al - HLA-DR: comparao entre sorologia e PCR-SSP

Tabela 1 Resultados da determinao de antgenos HLA-DR por microlinfocitotoxicidade e por PCR-SSP. a) Anti-soros policlonais e b) Anticorpos monoclonais a) Anti-soros Policlonais HLA-DR PCR a % b % c % total erros % corretos % 1 6 2 33,33 0 0 2 33,33 4 66,67 2 16 0 0 11 68,75 11 68,75 5 31,25 3 8 3 37,50 0 5 62,50 8 100,00 0 0,00 4 10 2 20,00 0 0 2 20,00 8 80,00 5 18 0 6 33,33 2 11,11 8 44,44 10 55,56 6 23 7 30,43 4 17,39 9 39,13 20 86,96 3 13,04 7 18 1 5,56 0 0 1 5,56 17 94,44 8 5 0 0 0 0 5 100,00 9 4 2 50,00 0 0 2 50,00 2 50,00 10 5 1 20,00 1 20,00 0 2 40,00 3 60,00 branco 5 0 *1 20,00 0 1 20,00 4 80,00 totais 118 18 12 27 57 48,31 61 b) Anticorpos Monoclonais HLA-DR PCR a % b % c 1 16 2 12,50 1 6,25 0 2 21 4 19,05 0 1 3 15 0 1 6,67 7 4 21 2 9,52 0 0 5 17 0 1 5,88 0 6 25 6 24,00 2 8,00 3 7 20 1 5,00 0 0 8 7 0 0 0 9 2 0 0 0 10 6 1 16,67 2 33,33 0 branco 8 0 0 0 totais 158 16 7 11 a - brancos, ou seja, antgenos no assinalados b - trocas, ou seja, antgenos com assinalao falsa c - indefinio de subespecificidades, apenas nos antgenos DR2, DR3, DR5 e DR6 * - um caso em que houve assinalao pela sorologia e no pelo PCR

% total erros 3 4,76 5 46,67 8 2 1 12,00 11 1 0 0 3 0 34

% 18,75 23,81 53,33 9,52 5,88 44,00 5,00 50,00 21,52

corretos 13 16 7 19 16 14 19 7 2 3 8 124

% 81,25 76,19 46,67 90,48 94,12 56,00 95,00 100,00 100,00 50,00 100,00

Summary
We have compared HLA-DR analysis obtained by DNAbased or by microlymphocytotoxicity typing with A) polyclonal antisera or B) monoclonal antibodies of samples from donors and recipients for kidney and bone marrow transplants. Polyclonal antisera show lower resolution of the HLA-DR specificities. Monoclonal antibodies show higher concordance rates to PCR-SSP. Thus, serological typings for HLA-class II have lower accuracy when compared to PCR, with approximately 48% of misstypings in group A and 21% in group B. The capacity of PCR-SSP in defining HLA-DR antigens is clearly increased when compared to serology, rendering donor-recipient matching more accurate and concurring to a better graft survival.

Referncias
1. 2. 3. Dausset J, Pla H. HLA-Complexe majeur dhistocompatibilit de lhomme. Flammarion Mdicine-Sciences, Paris, 1989, 414 Dausset J. Iso-leucoanticorps. Acta Haematol. 1958; 20: 156-9 Bryan CF, Harrell KM, Nelson PW, Pierce GE, Ross G, Shield III CF,Warady BA, Aeder MI, Helling TS, Landreneau MD, Luger AM. HLA-DR and DQ typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primer mixes reduces the incidence of phenotypic homozygosity (blanks) over serology. Transplantation. 1996; 62: 1819-24 Technical Handbook of Twelth International Histocompatibility. Workshop and Conference St.-Malo, Paris, June 3-12, 1996 (in press)

4.

J. Bras. Nefrol. 1997; 19(4): 381-385

385

M. L. C. Marin et al - HLA-DR: comparao entre sorologia e PCR-SSP

5.

Danilovs JA, Ayoub G, Terasaki PI. B Lymphocyte isolation by thrombin-nylon wool. In Terasaki PI ed. Histocompatibility Testing. UCLA, Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, 1980, 287-8 Amos DB, Pool P. HLA typing. In Rose NR. Friedman H. Manual of Clinical Immunology, American Society for Microbiology, New York, 1976, 797-804 Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: An alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens. 1992; 39: 225-35

Artigo recebido em 14 de abril de 1997 e aceito para publicao em 22 de setembro de 1997.

6.

7.