D N A M I C R O A R R AY

M I C R O A R R A N J O S D E D N A
 M I C R O A R R AY
É U M A C O L E Ç Ã O D E P O N T O S
M I C R O S C Ó P I C O S ,
U S U A L M E N T E P R E E N C H I D O S
C O M D N A , Q U E C O N T É M
S O N D A S P A R A D E T E R M I N A D A S
M O L É C U L A S - A L V O E Q U E
P R O D U Z E M R E S U L T A D O S
Q U A N T I T A T I V O S D E
E X P R E S S Ã O G Ê N I C A .
 M I C R O A R R AY
Avaliação da expressão gênica ou análise de DNA (variante genética) em larga escala.
 M I C R O A R R AY

Também conhecida como biochip de DNA, foi inicialmente

descrita por Schena eI al., em 1995;

Quantificação simultânea dos níveis de expressão de milhares

de genes (4.000 a 50.000 medições por amostra);

Gera grandes quantidades de dados trazendo benifícios no

custo do teste;

Necessita de ferramentas de Bioinformática para

interpretação dos dados;
PRICÍPIO DO
ENSAIO

• Princípio de complementaridade de ácidos nucleicos.

• Essa propriedade é o que permite a hibridização entre as

sondas de DNA fixadas no suporte sólido e a sequência
alvo a ser analisada.
CHIP DE DNA
•SPOTTING é o processo de fixação mecanica das sondas em
uma superfície (vidro, plastico ou chips de silício);

•Formado por milhões de SONDA e, desta forma, é possivel

identificar milhares de sequencias gênicas (genes ou variantes
genética) ALVO em uma única amostra;

•Onde ocorre a HIBRIDIZAÇÀO.

SONDAS
DNA
• Fragmento de DNA fita simples com 25 pares de bases (25-meros)
conhecidos, ou seja, as sequências correspondentes aos genes de interesse,
que está ligado ao chip;

• Oligonucleotídeos sintéticos ou cópias de mRNA (cDNA) amplificadas por

PCR.
 • Materiais genéticos a serem analisados (alvos);

• Quando o ensaio visa quantificar a expressão de determinados genes, os mRNAs são

convertidos em cDNAs por transcrição reversa, que são amplificados e posteriormente
marcados fluorescentemente.

A LV O
 HIBRIDIZAÇÃO DE SEQUÊNCIAS
CORRESPONDENTES DE DNA OU RNA
HIBRIDIZAÇÃO
• Base para a função dos microarranjos;

• O processo de unir duas fitas complementares de DNA

para formar uma molécula de fita dupla;

• Ocorre devido a regras complementares de

emparelhamento de bases (A – T, e C – G);

• A hibridização das sondas contra o RNA na amostra de

uma célula em estudo é a chave para a função do
genechip;
•Após o período de incubação, a placa é lavada para que os
cDNA sem correspondência sejam retirados.

•Por fim, a placa é inserida em um scanner próprio para análises

de microarray, que excita os marcadores fluorescentes para que
emitam luz (sinal), que é captado e processado pelo
equipamento.
E TA PA S D A
TÉCNICA
1. Bioquímica
• Fixação dos DNAs nas lâminas
• Extração do RNA e Hibridização
2. Bioinformática
• Aquisição das imagens
• Análises das imagens
• Normalizaçao dos dados
• Analise dos dados
PRINCÍPIO DO MÉTODO
TÉCNICA
• Lâmina de vidro: sobre a qual são impressas seqüências de DNA
conhecidas (fita simple);

• Sondas: produtos de PCR, oligonucleotídeos;

• Extraçao de RNAs: de duas condiçoes distintas e é convertida em

cDNA;

• cDNA são sintetizados com nucleotídeos marcados com

fluorescência distinta nas duas amostras;

• A amostra misturadas são adicionadas ao chip submetendo-as à

hibridização com as sondas específicas de interesse;

• permitindo que os alvos presentes em solução sejam pareados e

assim possam revelar a expressão dos genes;

• Competição entre as duas populações de cDNA pelas sondas, e a

resposta final é um resultado relativo de expressão entre as duas
populações.
 Patogênica Normal
Amostras contendo RNA
Células normais
Células Patogênicas

Transcrição Reversa Ambas

Não presente

cDNA

Spots

Sonda: fragmento de DNA fita

simples conhecido
I N T E R P R E TA Ç Ã • Nos ensaios de expressão gênica, por exemplo, podem ser utilizados
dois grupos de mRNA (cDNA): um obtido de células tratadas com
O DO TESTE medicamento X (marcado com fluoróforo vermelho) e outro de células
controle (marcado com fluoróforo verde).
• Célula tratada expresse determinado gene em quantidades muito
maiores do que a célula controle, a luz emitida será vermelha.
• Se ambas as células expressarem o gene em proporções semelhantes,
uma mistura das cores (resultando no amarelo) será exibida.
• Célula controle expresse mais (ou exclusivamente) deste determinado
gene, o que será traduzido na captação de luz verde pelo equipamento;
• Nenhum dos materiais genéticos empregados no ensaio encontrem
uma sonda equivalente na placa, resultando na ausência da emissão de
luz.
Devido a grande quantidade de dados gerados em um LEITURA POR SCANNER
experimento de array, a análise da expressão gênica requer
ferramentas estatísticas para identificar os genes
diferencialmente expressos.

ANÁLISE POR BIOINFORMÁTICA

APLICAÇÃO
• Identificação de marcadores associados a patologias diversas;
• Farmacogenômica, uma área em expansão, que visa identificar
marcadores associados à resposta a drogas;
• Descoberta de medicamentos, incluindo determinação de
biomarcadores, toxicogenômica, seletividade de alvos;
• Identificando alterações no número de cópias de um gene, mutações
e demais modificações que possam interferir na sua função;
• Desenvolvimento de testes prognósticos;
• Determinação de subclasses de doenças;
• Identificação e caracterização de microrganismos.
UTILIZAÇÃO CLÍNICA
• Academia Americana de Genética indica para o estudo de crianças e adultos com suspeitas de síndromes
genéticas, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e autismo.

• Ele permite identificar alterações que não são vistas no cariótipo convencional;

• Suspeita clínica de síndromes de microdeleções e/ou microduplicações;

• Quadros sindrômicos a esclarecer, como anomalias congênitas múltiplas, deficiência intelectual, atraso de
desenvolvimento neuropsicomotor, baixa estatura, transtorno do espectro autista (TEA) e dificuldades de
aprendizado.
UTILIZAÇÃO CLÍNICA
• Análise de eventos moleculares responsáveis pela progressão das doenças, como por exemplo, de
displasia a câncer e de carcinoma in situ a invasivo;

• Marcadores específicos ou perfis preditivos para a doença em questão e evolução da doença,

como mortalidade;

• Modelos biológicos alterados e associá-los a novos alvos terapêuticos.

 Fornece subsídios para o diagnóstico, avaliação do prognóstico, e identificação de novos
alvos terapêuticos.
EXPRESSÃO Exemplos:
GENICA • Linhagens celulares melanoticas

1. Sem potencial tumorigênico: com introdução de um cromosso 6 humono normal

(UACC-903(+6))
CLASSIFICAÇÃO 2. Com potencial tumorigênico: sem introdução do cromossomo (UACC-903)
MOLECULAR DO
CÂNCER
• Linfoma difuso de células B grandes

1. Linhagens morfologicamente iguais mas molecularmente diferentes levando a

respostas ao tratamento diferentes

• Niveis de expressão do gene PART-1 em célular LNCaP de cancêr de prostata expostos a

andrógenos.
OUTRAS ÁREAS DE USO
• Biotecnologia Agrícola (Desenvolvendo as cepas perfeitas de plantas);
• Testes Ambientais (Testando as causas da degradação ambiental);
• Testes de Alimentos (Testes de contaminantes como outros alimentos ou patógenos)
• Diagnóstico/Classificação de Gado (Projetando os melhores animais e classificando sua qualidade e
segurança);
• Testes de identidade (Quem são os pais? Essa pessoa pode ser parente?);
• Medicina individualizada ( Prescrever a melhor combinação de medicamentos para um pessoa);
• Diagnóstico humano (Diagnóstico de doenças);
• Pesquisa Básica (A identificação de genes/DNA-chave no início da pesquisa).
D E S VA N T A G E N S
• Embora os estudos possam monitorar mudanças globais, os mesmos são limitados pelo acesso e
custo;
• Há também a falta de padrões rigorosos para coleta dos dados, análise e validação;
• A qualidade e quantidade do RNA permanecem como um grande desafio nos experimentos,
devido a instabilidade da molécula de RNA. O rápido processamento para manter a integridade
do RNA é crucial, pois dados falsos podem ser gerados a partir de RNA degradado;
• Heterogeneidade entre os diferentes estudos de microarray devido aos diferentes métodos de
geração e análise dos dados.
OBRIGADA!