Tecnologia do DNA recombinante

Endonucleases de restrição
 Enzimas;

 Observadas em bactérias: como as bactérias identificam DNAs virais e os destroem?

 Por que o DNA da bactéria não era destruído?

 As enzimas restringem a reprodução viral, clivando o DNA estranho;

 Como? Elas reconhecem e cortam a dupla-hélice do DNA viral de forma muito precisa,
reconhecendo sequências específicas entre 4 e 8 pares de bases;
 Plasmídios
 DNA extracromossômico presente em bactérias;
 DNA circular;
 Apresenta características relacionados à resistência à antibióticos;
 Transferidos para as células –filhas durante o processo de conjugação
 Produção do DNA recombinante
 Utilizando endonucleases de restrição, um gene de interesse é cortado da molécula de DNA;
 Esse gene é colado em um plasmídio, utilizando a enzima DNA ligase;
 O plasmídio é inserido em uma bactéria, e o gene é transferido durante vários processos de
reprodução.
 Produção de insulina

 https://www.youtube.com/watch?v=PAbNhal-NZ0
 Outros vetores de clonagem
 Bacteriófagos;
 Cosmídeos (genes grandes);
Outros vetores de clonagem
 Aplicações da tecnologia do DNA recombinante
 Conjunto de técnicas que garantem a manipulação do DNA de organismos, alterando as
capacidades de cada espécie;

 4 fases:

-Identificação do fragmento de interesse;

-Isolamento do gene;
-Introdução do gene no genoma da célula hospedeiro;
-Seleção de células portadoras das moléculas de DNA desejado.
 Técnica de PCR
 Reação em cadeia da polimerase;
 Permite aumentar a quantidade de um DNA alvo;
 Pode produzir, em poucas horas, milhões de sequências de DNA utilizando apenas uma
molécula original;
 Possível pela capacidade de replicação da molécula de DNA;

 Materiais necessários:
-Sequência de DNA alvo;
-Os quatro desoxinucleotídeos: A, T, C e G;
-Taq polimerase (resistente a altas temperaturas);
-Solução-tampão de pH;
-Primers.
Etapas da PCR
Etapas da PCR
 Eletroforese
 Processo utilizado para separar e visualizar fragmentos de DNA amplificados pela PCR;
 Toda molécula de DNA e RNA apresentam carga negativa (fosfato);
 As amostras são colocadas em pequenos poços em gel de agarose e este em uma cuba
ligada à uma fonte de energia;
 Com a presença de DDP (diferença de potencial) as moléculas migram para o polo
positivo;
 Fragmentos de tamanhos diferentes movem-se em velocidades diferentes originando
bandas ou faixas.
 Pela análise da distância entre as bandas é possível calcular o tamanho do fragmento de
DNA.
Eletroforese
 Eletroforese

 Ao final da “corrida” o gel é corado (brometo de etídio / Sybr Safe) e as bandas podem
ser visualizadas em luz ultravioleta.
Eletroforese
 Técnica de fingerprint
 Sequências de DNA utilizadas para a identificação de pessoas;
 Focam em regiões que não expressam mutações, ou seja, que conferem a cada indivíduo uma
sequência única (VNTrs – vinters);
 Técnica de fingerprint
 Utilização para investigação criminal e teste de paternidade:
 Clonagem de um gene específico

 1º passo: Extração de ácidos nucleicos das células/tecidos;

 2º passo: Purificação do DNA ou do RNA;
 3º passo: Seleção do fragmento alvo utilizando endonuclease de restrição;
(caso seja selecionado um fragmento de RNA, é necessário sintetizar cDNA, utilizando a enzima
transcriptase reversa);
 4º passo: amplificação do fragmento (PCR) eletroforese para visualização do fragmento;
 5º passo: introdução em um vetor de clonagem (plasmídio), o qual é inserido em uma bactéria;
Clonagem de um gene específico
 Obtenção de plantas transgênicas
 Resistência à herbicidas, ao ataque de insetos e microrganismos, secas prolongadas e
melhoramento qualitativo e quantitativo de óleos, proteínas, vitaminas, entre outros.
 Obtenção de animais transgênicos
 Aprimora características tendo em vista sua utilização por seres humanos (resistência à
doenças, maior produtividade de carne e leite, etc.);
 Atividade avaliativa
 Montagem de mapa conceitual sobre: aplicações de OGM´s e Riscos do uso de OGM´s

 Livro 3, páginas 70 a 72.

 Atividade individual (valor: 1,0).

 Entrega: Até 15/09 via foto no classroom.