Tecnologia do DNA

recombinante: Purificação

Prof. Me. Genilson Júnior

Purificação de proteínas

Uma vez nossa proteína feita, como purifica-la?

1- Por que precisamos fazer a Purificação?

2- Como purificar proteínas? (tipos de cromatografia)

3- Exemplos de proteínas.
Seminários

1. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

2. Sequenciamento de DNA e microarranjos de DNA.
3. Células tronco; terapia gênica.
4. Farmacogenômica/Farmacogenética
Tecnologia do DNA
recombinante:
Bibliotecas de DNA

Prof. Me. Genilson Júnior

Tecnologia do DNA

DNA Genômico

Bibliotecas de DNA

cDNA
Biblioteca de DNA genômico

➢ É uma coleção de clones que representam a totalidade do

genoma de um determinado organismo;

➢ Consiste de todas as moléculas de DNA recombinantes que

foram geradas pela ligação do DNA do organismo a um
vetor (plasmídeo, bacteriófago ou cosmídeos)

➢ Serve para isolar DNA específicos de um organismo.

Biblioteca de DNA genômico
Características

✓ São usadas principalmente para procariotos;

✓ Em eucariotos usa-se biblioteca genômica para estudo de

regiões reguladoras;

✓ Independe do tipo de célula utilizada para a obtenção do

DNA.
Biblioteca de DNA genômico
Biblioteca de DNA genômico
Biblioteca de DNA genômico
Biblioteca de cDNA

➢ É o conjunto de clones das sequências codificadoras que

estão sendo expressas pela célula naquele momento,
obtido através da clonagem de moléculas cópias do
mRNA;

➢ É usada principalmente para células eucarióticas;

➢ Varia de acordo com o tecido utilizado

Biblioteca de cDNA
Síntese de cDNA

Purificação do RNA

Hibridização com poly(dT)

Copia do DNA com RT

Degradação do RNA

Síntese de uma fita complementar

Síntese de cDNA
Clonagem de cDNA por
fago λ
Etapas na construção das
bibliotecas de DNA genômico
e cDNA
Tecido
DNA
RNAm
Digerir o DNA (parcial ou completo)

Fracionar por tamanho

cDNA

DNA clonável Vetor de clonagem

Ligação do DNA Introduzir em E. coli

Titulação e caracterização da biblioteca

Diferenças das bibliotecas
Genômico
Representa uma amostra
aleatória de todas as sequências
de DNA de um organismo
cDNA
- Contém moléculas que foram
transcritas em mRNA;
- Produção de grande quantidade
de mRNA por células
especializadas;
- Varia de acordo com o tipo e
estado fisiológico da célula;
- mRNA é processado
Vantagens da cDNA

✓ Não tem introns, o que facilita a identificação e a caracterização dos genes,

não havendo perigo de que peças de um determinado gene sejam
recuperadas por outros genes;
✓ O cDNA apenas representa os genes que estão a ser ativamente utilizados pela
célula, pois a RNA polimerase apenas transcreve genes ativados;
✓ A biblioteca de cDNA fique enriquecida para esse determinado gene, porque,
em vez de termos uma ou duas cópias, temos tantas cópias quantos mRNAs a
célula conseguir produzir para esse gene;
✓ As bibliotecas de cDNA são mais fáceis de construir porque o cDNA, tal como o
seu mRNA molde, é relativamente pequeno, portanto um cDNA inteiro pode
ser inserido num único vector. Apesar disso, mantém-se a necessidade de
construir uma biblioteca uma vez que as células produzem dezenas de
milhares de mRNAs diferentes ao mesmo tempo, e portanto, depois de
usarmos a trancríptase reversa, continuamos com uma grande quantidade de
diferentes cDNAs.
Triagem de uma biblioteca
Hibridização com SONDAS

Há dois tipos de sondas: 1 – reconhece o DNA de interesse e 2 – reconhece

uma proteína específica.
Triagem de uma biblioteca

Há dois tipos de sondas: 1 – reconhece o DNA de interesse e 2 – reconhece

uma proteína específica.
Triagem de uma biblioteca
Triagem de uma biblioteca

Técnicas de hibridização de sondas.

WESTERN, SOUTHERN OU NORTHERN BLOTTING.
Triagem de uma biblioteca

Saber se na amostra tem o DNA recombinante

✓ Outro método é a eletroforese do DNA como

marcador de peso molecular;

✓ Conhecendo o tamanho do DNA recombinante;

✓ Corado com brometo de etídio X corante de

safer;

✓ O DNA de interesse pode ser recuperado.

Determinação da sequência de bases
de um segmento de DNA
Determinação da sequência de bases
de um segmento de DNA
Determinação da sequência de bases
de um segmento de DNA

Marcação fluorescente para cada ddNTP – toda reação pode ocorrer em um mesmo tubo.
Quais os elementos necessários à reação enzimática ou
terminação de cadeia que permite a descrição da sequência de
nucleotídeos de uma molécula de DNA? E como esse
sequenciamento ocorre?

Qual a relação entre a PCR (reação em cadeia polimerase) e

microarranjos de DNA?

Quais as possíveis aplicações dos microarranjos de DNA?